肝纖維化（fibrosis of liver）是由各種慢性肝病發(fā)展到肝硬化、肝癌的中間必經(jīng)階段,主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)（extracelluar matrix,ECM）在肝內(nèi)的大量沉積,并由此導(dǎo)致肝臟功能損傷。其中膠原是ECM的主要來(lái)源是,抑制膠原的合成能夠減慢肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。TGF-β1是公認(rèn)的調(diào)控肝纖維化形成的因子,在肝纖維化疾病過(guò)程中,TGF-β1激活HSC,促使ECM產(chǎn)生,同時(shí)會(huì)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶,使膠原降解減少,逐漸加重肝纖維化。Smad2和Smad3作為TGF-β信號(hào)下傳的主要效應(yīng)分子,結(jié)構(gòu)上相似,但功能呈多樣化。在肝纖維化中,Smad3是致病性的,而Smad2所扮演的具體角色還不確定。本研究采用皮下注射50%CCl4植物油溶液（1ml/kg）12周建立大鼠肝纖維化模型,TGF-β1刺激人肝星狀細(xì)胞株LX-2為細(xì)胞模型,采用激光共聚焦、分子生物學(xué)、明膠酶譜等手段檢測(cè)肝纖維化病程中Smad2和Smad3的表達(dá)變化。（1）Smad2和Smad3在肝星狀細(xì)胞中表達(dá)采用CCl4皮下注射SD大鼠12周,復(fù)制模型。HE和Masson染色結(jié)果顯示模型組大鼠肝組織出現(xiàn)肝纖維化的病理變化... 

【文章來(lái)源】：安徽醫(yī)科大學(xué)安徽省

【文章頁(yè)數(shù)】：73 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
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中文摘要
Abstract
1 前言
2 實(shí)驗(yàn)材料
    2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞
    2.2 藥品與試劑
    2.3 儀器與設(shè)備
3 實(shí)驗(yàn)方法
    3.1 CCl4 誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型
    3.2 肝臟病理學(xué)檢測(cè)
        3.2.1 HE染色
        3.2.2 Masson染色
    3.3 人肝星狀細(xì)胞LX-2 培養(yǎng)
    3.4 Smad2-si RNA, Smad3-si RNA轉(zhuǎn)染LX-2
        3.4.1 si RNA設(shè)計(jì)原則
        3.4.2 實(shí)驗(yàn)分組及時(shí)間點(diǎn)
        3.4.3 轉(zhuǎn)染
    3.5 質(zhì)粒提取
        3.5.1 LB培養(yǎng)基的配制
        3.5.2 質(zhì)粒提取
    3.6 Smad2,Smad3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒干擾實(shí)驗(yàn)
    3.7 肝臟組織/LX-2細(xì)胞總RNA的提取(Trizol法)和逆轉(zhuǎn)錄
        3.7.1 組織/細(xì)胞總RNA提取
        3.7.2 總RNA定量
        3.7.3 逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程(c DNA的合成)
    3.8 PCR擴(kuò)增
        3.8.1 引物序列
        3.8.2 Real-time PCR
    3.9 Western blot試驗(yàn)
        3.9.1 用液的配制
        3.9.2 蛋白樣品制備
        3.9.3 BCA法蛋白定量
        3.9.4 SDS-PAGE電泳
    3.10 免疫熒光
    3.11 明膠酶譜試驗(yàn)
        3.11.1 操作原理
        3.11.2 操作步驟
    3.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
4 結(jié)果
    4.1 Smad2 和Smad3 在肝星狀細(xì)胞中表達(dá)
        4.1.1 模型組大鼠肝組織病理變化
        4.1.2 Col.I的變化
        4.1.3 p-Smad2 和p-Smad3 在肝星狀細(xì)胞表達(dá)
    4.2 沉默Smad2、Smad3 基因后,膠原沉積的變化
        4.2.1 小干擾RNA技術(shù)沉默Smad2 和Smad3
        4.2.2 沉默Smad2,Smad3 后,Col.I表達(dá)變化
    4.3 過(guò)表達(dá)Smad2、Smad3 后,膠原沉積的變化
        4.3.1 質(zhì)粒過(guò)表達(dá)Smad2,Smad3
        4.3.2 過(guò)表達(dá)Smad2,Smad3 后,Col.I表達(dá)變化
    4.4 沉默Smad2、Smad3 后,膠原降解的變化
        4.4.1 沉默Smad2,基質(zhì)降解不平衡
        4.4.2 明膠酶譜檢測(cè)MMP-2 酶的活性
    4.5 過(guò)表達(dá)Smad2、Smad3 后,膠原降解的變化
        4.5.1 過(guò)表達(dá)Smad2 基因,基質(zhì)的降解不平衡
        4.5.2 明膠酶譜檢測(cè)MMP-2 酶的活性
    4.6 Smad2 抑制纖維化的機(jī)制研究
        4.6.1 沉默Smad2 后P- Smad3 的核轉(zhuǎn)位增加
        4.6.2P-Smad3 總與Smad2 呈相反的表達(dá)趨勢(shì)
5 討論
6 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
綜述
    參考文獻(xiàn)



本文編號(hào)：3258806