研究背景和目的治療性重組蛋白的生產(chǎn)是生物制藥中重要的一部分,而重組糖蛋白用于治療許多疾病。通常情況下,哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)是生物制藥的首選體系。中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary,CHO）細(xì)胞是最常用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系,用其作為宿主,能產(chǎn)生接近人源糖蛋白糖基化的治療性重組糖蛋白。人源細(xì)胞和CHO細(xì)胞糖基化最大的不同就是CHO細(xì)胞有兩個(gè)糖基化酶,α-1,3-半乳糖轉(zhuǎn)移酶（α-1,3-Galactosyltransferase,GGTA1）和胞苷酸N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶（CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylase,CMAH）,而這兩個(gè)酶在人體中已經(jīng)缺失。在用CHO細(xì)胞生產(chǎn)治療性糖蛋白時(shí),GGTA1產(chǎn)生的α-1,3-半乳糖（α-1,3-galactose,α-gal）和CMAH產(chǎn)生的N-羥乙酰神經(jīng)氨酸（N-glycolylneuraminic acid,Neu5Gc）會(huì)引起人體的免疫反應(yīng)。本研究應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)CHO細(xì)胞進(jìn)行遺傳改造,構(gòu)建了CMAH和GGTA1基因突變的CHO細(xì)胞株,希望改進(jìn)治療性重組糖蛋白的治療安全... 

【文章來源】：鄭州大學(xué)河南省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：90 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
中英文縮略詞
前言
材料和方法
    1 材料
        1.1 載體
        1.2 細(xì)胞系
        1.3 主要試劑和儀器
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 CHO-S細(xì)胞CMAH位點(diǎn)Crispr/Cas9系統(tǒng)載體的構(gòu)建
        2.2 轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞篩選高效率的切割載體pGL3-U6-CMAH-sgRNA
        2.3 流式分選并獲取單克隆細(xì)胞
        2.4 CMAH基因定點(diǎn)突變細(xì)胞的鑒定
        2.5 GGTA1基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)載體的構(gòu)建
        2.6 轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞篩選高效率的切割載體pGL3-U6-GGTA1-sgRNA
        2.7 流式分選并獲取單克隆細(xì)胞
        2.8 鑒定GGTA1基因是否發(fā)生突變
        2.9 細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)
        2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
結(jié)果
    1 CMAH基因突變的CHO-S細(xì)胞構(gòu)建成功
        1.1 pGL3-U6-CMAH-sgRNA載體的酶切鑒定結(jié)果
        1.2 pmCherry-EGFP-CMAH-Reporter載體的酶切結(jié)果
        1.3 篩選出高效的pGL3-U6-CMAH-sgRNA切割載體
        1.4 pGL3-U6-CMAH-sgRNA1、pmCherry-EGFP-CMAH-Reporter和Cas9共轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞CHO-S細(xì)胞的熒光結(jié)果
        1.5 CMAH基因突變的CHO-S細(xì)胞基因組DNA的PCR產(chǎn)物結(jié)果
        1.6 CMAH基因突變的CHO-S細(xì)胞基因組RNA的Q-PCR結(jié)果
    2 在CMAH基因突變的CHO-S細(xì)胞基礎(chǔ)上GGTA1基因突變的CHO-S細(xì)胞構(gòu)建成功
        2.1 pGL3-U6-GGTA1-sgRNA載體的酶切鑒定結(jié)果
        2.2 pmCherry-EGFP-GGTA1-Reporter載體的酶切結(jié)果
        2.3 篩選出高效的pGL3-U6-GGTA1-sgRNA切割載體
        2.4 pGL3-U6-GGTA1-sgRNA1、pmCherry-EGFP-GGTA1-Reporter和Cas9共轉(zhuǎn)染CMAH基因突變的CHO-S細(xì)胞的熒光結(jié)果圖
        2.5 GGTA1基因突變的CHO-S細(xì)胞基因組DNA的PCR產(chǎn)物結(jié)果
        2.6 GGTA1基因突變的CHO-S細(xì)胞基因組RNA的Q-PCR產(chǎn)物結(jié)果
    3 細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.2 突變株細(xì)胞表達(dá)外源蛋白的能力
討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)（綜述）
個(gè)人簡歷
致謝



本文編號(hào)：3163176