發(fā)布時(shí)間：2021-03-18 09:12

　　目的:天然抗菌肽Dermaseptin B2除了有廣譜的抗菌活性,還具有抗腫瘤活性、溶血活性低的優(yōu)勢(shì),且對(duì)部分動(dòng)物細(xì)胞沒有毒性,因而有很好的研究前景和意義。已有研究表明Dermaseptin B2的抗菌活性取決于N端、C端螺旋非極性面疏水殘基的數(shù)量及其側(cè)鏈大小。本研究通過用亮氨酸替換N端、C端的絲氨酸的方式改造Dermaseptin B2,經(jīng)生物信息學(xué)手段分析后,構(gòu)建Dermaseptin B2及改造肽Dermaseptin B2^m的原核表達(dá)體系,并做初步的抗菌活性比較研究。方法和結(jié)果:1.天然抗菌肽的改造已有研究表明,Dermaseptin B2通過增加N端、C端的疏水殘基的數(shù)量,或者選用側(cè)鏈大的疏水殘基替換側(cè)鏈小的疏水殘基能夠提高其抗菌活性。本研究的改造方案是,一是用亮氨酸替換Dermaseptin B2 N端、C端的絲氨酸,利用生物信息學(xué)手段分析表明,其疏水性有所提高。二是從NCBI Gene bank中獲得的Dermaseptin B2的mRNA序列轉(zhuǎn)換成cDNA序列,在其5’端添加腸激酶切割位點(diǎn)（5’-GACGACGACGACAAG-3’）,以便后續(xù)蛋白... 

【文章來源】：蘭州大學(xué)甘肅省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：69 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

pET-32a(+)質(zhì)粒

抗菌肽 Dermaseptin B2、改造學(xué)碩士學(xué)位論文 的構(gòu)建和抗菌活性比為 50：1 配制而成，充分混勻，室溫 24 h 內(nèi)穩(wěn)定。稀釋標(biāo)準(zhǔn)品：96 孔板中第一孔加 40 μl PBS，后面 2-7 孔每孔加孔中加入 10 μl BSA 標(biāo)準(zhǔn)品使其終濃度為 1000 μg/mL，取 25 均勻，依次類推，至第六孔混合均勻后取 25 μl 棄掉。1-7 中 B 1000、500、250、125、62.5、31.25、0 μg/mL。取樣品 25 μl 到 96 孔板中。各孔加 200 μl BCA 工作液，37℃放置 30 min。用酶標(biāo)儀測(cè)定曲線計(jì)算出蛋白濃度。

圖 3.2 DRS B2 基因合成結(jié)果 圖 3.3 DRS B2m基因合成結(jié)果（圖 3.2，M:DNAmarker；1-10： DRS B2 基因 PCR 產(chǎn)物）（圖 3.3，M:DNAmarker；1-10：DRS B2m基因 PCR 產(chǎn)物）3.3 表達(dá)載體構(gòu)建結(jié)果3.3.1 目的基因、表達(dá)載體雙酶切及連接結(jié)果為了后續(xù)構(gòu)建表達(dá)載體，在設(shè)計(jì)目的基因時(shí)引入 EcoRⅠ和 KpnⅠ酶切位點(diǎn)，目的基因經(jīng)雙酶切制備表達(dá)載體連接小片段（129 bp），通過 2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)酶切片段進(jìn)行鑒定，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，在 100-150 bp 之間有一明顯的條帶（見圖 3.4，3.5），說明目的基因雙酶切消化成功，可用于下一步連接反應(yīng)。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]抗菌肽改良設(shè)計(jì)及抗炎作用的研究進(jìn)展[J]. 楊靜,賈如涵,李文慧,石大林,邵明洋,韓躍武.  中國(guó)生物工程雜志. 2018(01)
[2]重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展[J]. 安新玲,韓金祥,王世立.  生物技術(shù)通訊. 2009(06)
[3]抗菌肽CM4組分對(duì)寄生曲霉抗性機(jī)制的研究[J]. 徐進(jìn)署,張雙全.  自然科學(xué)進(jìn)展. 2001(12)



本文編號(hào)：3088090