目的:通過研究鳶尾素（Irisin）對大鼠BMSCs成骨分化的影響及相關信號通路,探討Irisin作為組織工程骨生長因子的可行性及其對骨缺損愈合的影響。方法:體外培養(yǎng)大鼠BMSCs,分離純化、鑒定;設置Irisin不同濃度組（0、80ng/mL、100ng/mL、120ng/mL）,CCK-8法選擇Irisin的最佳實驗濃度。含有Irisin的培養(yǎng)液培養(yǎng)大鼠BMSCs為實驗組,單純培養(yǎng)液培養(yǎng)為對照組,3、7、14天進行茜素紅、von Kossa鈣鹽染色;3、10天進行RT-PCR和Western bolt檢測,分析成骨相關基因的mRNA及蛋白表達。建立股骨缺損的大鼠模型,實驗分3組:實驗組:Irisin復合支架;對照組:無Irisin復合支架;空白組。將三組材料植入大鼠模型的缺損區(qū)域,MicroCT、HE染色及免疫組化分析,檢測缺損區(qū)域的骨愈合和皮質(zhì)骨再生情況。結果:1.流式細胞測定表明:BMSCs表面表達CD29（98.4%±2.1%）在高水平,CD45（2.9%±0.4%）表達低水平。2.從3天開始濃度100ng/mL的培養(yǎng)液促進大鼠BMSCs增殖活性的效果逐漸明顯（P<0.... 

【文章來源】：新疆醫(yī)科大學新疆維吾爾自治區(qū)

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

BMSCS細胞膜的培養(yǎng)及細胞膜-支架復合物的構建(50×)

新疆醫(yī)科大學碩士學位論文11圖2組織工程骨模型回植過程Fig.2Tissueengineeringbonemodelreplantingprocess2.7組織工程骨回植動物的相關檢測3D打印組織工程支架包裹預先浸提的細胞膜片（OM），回植SD大鼠股骨缺損模型，設置實驗組和對照組，并分別在第1個月、第2個月、第3個月時點，采集標本，行Micro-CT、HE染色、免疫組化等指標檢測，結合體外實驗結果，由此證實Irisin為體外、體內(nèi)性能俱佳的組織工程骨生長因子。2.7.1大體觀察按期處理實驗動物時先進行創(chuàng)口愈合情況評估：取出標本前按期觀察大鼠是否出現(xiàn)異常，是否出現(xiàn)消瘦，有無后肢活動障礙，傷口愈合是否延遲。取出標本時觀察大鼠股骨是否有感染壞死情況，是否出現(xiàn)炎癥反應，移植支架與周圍骨組織愈合情況，缺損周圍新骨形成，血供情況，支架初步降解情況等。2.7.2MicroCT分析骨缺損區(qū)的ROI區(qū)域按照實驗時間，對所有組的小鼠實施安樂死。分離出整個股骨并使用微型CT掃描。工作電壓為55kV，工作電流為145mA，以支架回植區(qū)域擴張1mm為實驗缺損區(qū)為感興趣區(qū)(regionofinterestROI)，掃描層的深度為20um，掃描的時間為3400msec。分析骨骼再生情況并計算新形成的骨骼的骨體積。通過比較MicroCT各項觀察值，評估缺損區(qū)ROI區(qū)域的新生骨質(zhì)情況和皮質(zhì)骨的生長情況，以及骨缺損的各項指標。2.7.3HE染色分析蘇木精和伊紅（HE）染色在室溫下進行，以觀察新形成的骨骼的骨再生狀況。

新疆醫(yī)科大學碩士學位論文14結果1BMSCs分離、培養(yǎng)與鑒定結果1.1大鼠BMSCs分離培養(yǎng)繪制生長曲線圖如圖3所示，鏡下觀察SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的形態(tài)變化。長期觀察總結成熟BMSCs細胞形態(tài)規(guī)律，排列具有趨向性，表現(xiàn)為長條形或梭形，個別變現(xiàn)橢圓形，隨著換液傳代，細胞逐漸純化，排列愈加規(guī)律，形態(tài)特征更加明顯。BMSCs分離培養(yǎng)后各代繪制的生長曲線圖見圖4。由圖可見，在傳代培養(yǎng)過程中，骨髓間充質(zhì)干細胞可迅速貼壁生長，觀察發(fā)現(xiàn)大約在傳代后3小時后開始粘附。細胞接種完成后生長較為緩慢，此階段為細胞生長的適應期；在大約3天時開始快速增殖，具有累積的細胞數(shù)，進去細胞生長的對數(shù)期，持續(xù)約4-6天；之后細胞增長速度逐漸趨于緩慢，進去平臺期。其中第三代細胞（P3）生長最為旺盛。abcd注：a:P1代細胞、b:P2代細胞、c:P3代細胞、d:P5代細胞P1代細胞融合度未達到95％，細胞中存在雜細胞；P2代細胞雜細胞數(shù)量減少，細胞排列較規(guī)律，形態(tài)呈現(xiàn)長梭形；P3代細胞融合度95％以上，且排列出顯著的方向性，活力旺盛。P5代細胞，細胞出現(xiàn)老化，融合度有所減少。圖3體外培養(yǎng)大鼠BMSCs各代細胞鏡下形態(tài)（5x）Fig.3CytologicalmorphologyofratBMSCsinvitro（5x）圖4P1、P3和P5代大鼠BMSCs生長曲線Fig.4GrowthcurvesofratBMSCsinP1,P3andP5generations

【參考文獻】：
期刊論文
[1]Irisin對高糖環(huán)境中BMSCs骨向分化的影響及機制研究[J]. 李金儒,位朵,甄國朋,郭濱.  華南國防醫(yī)學雜志. 2019(07)
[2]Exercise-induced irisin in bone and systemic irisin administration reveal new regulatory mechanisms of bone metabolism[J]. Jin Zhang,Paloma Valverde,Xiaofang Zhu,Dana Murray,Yuwei Wu,Liming Yu,Hua Jiang,Michel M Dard,Jin Huang,Zhiwei Xu,Qisheng Tu,Jake Chen.  Bone Research. 2017(01)



本文編號：3058045