工業(yè)上生產(chǎn)β-內(nèi)酰胺類抗生素的重要前體頭孢菌素C依靠其巨大的經(jīng)濟價值在抗生素市場上起著相當重要的作用,其主要生產(chǎn)菌絲狀真菌頂頭孢霉的研究也因此備受重視。頂頭孢霉在經(jīng)歷了傳統(tǒng)育種技術(shù)的多輪誘變和篩選過程后,其CPC生產(chǎn)能力得到顯著提升,但其高產(chǎn)背后發(fā)生的遺傳變異及代謝差異的分子機制尚未完全披露,這也在很大程度上限制了從分子育種角度進一步提升CPC產(chǎn)量的可能。目前,我們認識和理解頂頭孢霉的代謝網(wǎng)絡(luò)、調(diào)控機制得益于頭孢菌素C生物合成途徑的闡明和組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用,野生型菌株ATCC11550基因組測序的完成也使得頂頭孢霉比較基因組學(xué)的研究得以開展。我們設(shè)想通過研究頂頭孢霉高產(chǎn)菌株和野生型菌株之間的基因組差異,并結(jié)合之前本實驗室此前獲得的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù),對在菌種選育過程中發(fā)生的代謝調(diào)控突變進行全面深入的研究,探尋代謝調(diào)控突變影響CPC合成的機制。本文著眼于頂頭孢霉高低產(chǎn)菌CPC合成相關(guān)初級代謝途徑的基因序列分析,通過考察這些基因是否在高產(chǎn)菌株中發(fā)生突變從而影響到酶的活性,并結(jié)合之前轉(zhuǎn)錄水平的分析結(jié)果初步探究可能對頭孢菌素C代謝產(chǎn)生影響的因素。首先,以頂頭孢霉高產(chǎn)菌株LD-7基因組為模板,... 

【文章來源】：中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海市

【文章頁數(shù)】：79 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

頭孢菌素C生物合成基因簇及合成途徑Fig.1-1BiosyntheticgeneclustersandsyntheticpathwaysofcephalosporinC

圖 1-2 頭孢菌素 C 的生物合成及其細胞內(nèi)運輸[8]Fig.1-2 Biosynthetic pathway and intracellular transport of CPC盡管 CPC 的生物合成途徑已被基本闡明，但由于頂頭孢霉的遺傳操作困次級代謝的網(wǎng)絡(luò)又十分復(fù)雜，研究人員對 CPC 合成過程中復(fù)雜的調(diào)控機少，目前僅研究發(fā)現(xiàn)了少數(shù)幾個與 CPC 合成相關(guān)的調(diào)控基因(圖 1-3)。例基中添加葡萄糖時，由基因 cre1 編碼的葡萄糖依賴型抑制蛋白 CRE1 能子區(qū)域直接結(jié)合，達到抑制 CPC 合成基因 pcbC 和 cefEF 轉(zhuǎn)錄的目的[9]型鋅指轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 PACC 調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的過程是通過結(jié)合兩個雙向啟AB-pcbC 和 cefEF-cefG 的特定位點來實現(xiàn)的[10]。與人類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 X(同源的蛋白 CPCR1 可以控制菌絲片段化以及節(jié)孢子的形成，能夠至少識位于 pcbAB 和 pcbC 基因間區(qū)的兩段序列。lacZ 報告基因的活性會因為C 啟動子區(qū)的兩個 CPCR1 識別位點的同時缺失而大幅度降低；另外，pcb水平也會在敲除CPCR1后大幅下降，隨之減少的則是中間物青霉素N的產(chǎn)這一系列的變化卻并沒有引起 CPC 產(chǎn)量的變化，由此可以看出 CPC 的生

級代謝調(diào)控的因子常常對 CPC 的生物合成也具有調(diào)控作用，它們很可能是在這種交互調(diào)控的過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。例如氮源調(diào)控基因 AcareA 和 AcareB 不僅在NH4+、谷氨酰胺和尿素這些氮源的利用中起著關(guān)鍵作用，基因 AcareA 和 AcareB的缺失都可以導(dǎo)致 CPC 合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平及 CPC 產(chǎn)量的顯著降低。AcAreA能夠直接結(jié)合于pcbAB與pcbC之間的雙向啟動子區(qū)，而AcAreB還能與cefD1-cefD2和 cefEF-cefG 的基因間隔區(qū)結(jié)合。研究還發(fā)現(xiàn) AcAreA 能夠正向調(diào)控 AcareB 基因的轉(zhuǎn)錄，AcAreB 卻不能調(diào)控 AcareA 基因的轉(zhuǎn)錄[15,16]。AcsepH 基因與菌絲分隔有關(guān)，它的突變能夠?qū)е路稚咦赢a(chǎn)量下降 90%之多，并且有 20%的多細胞核分生孢子的 CPC 產(chǎn)量也有大幅度的下降，同時還會導(dǎo)致pcbC 基因轉(zhuǎn)錄延遲，cefEF、cefD1 和 cefD2 的轉(zhuǎn)錄水平也明顯降低[17]。AcstuA 基因也可以在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控 CPC 的合成，是另一個與分生孢子產(chǎn)生相關(guān)的調(diào)控基因，還參與細胞壁完整性的調(diào)控，當敲除 AcstuA 后，菌絲會呈現(xiàn)不規(guī)則的膨脹和斷裂[18]。對 CPC 合成與菌絲形態(tài)分化之間關(guān)系的研究，將不斷加深我們對頂頭孢霉中頭孢菌素 C 產(chǎn)生的認識和理解。


本文編號：2985847