發(fā)布時(shí)間：2021-01-02 16:27

　　心腦血管疾病是近年來(lái)威脅人類健康和生命的頭號(hào)殺手,血栓形成是許多心腦血管疾病的重要誘因,血栓一旦形成,往往形成不可逆的嚴(yán)重后果,抗凝劑是防治血栓形成的重要藥物。水蛭素（Hirudin,HV）是歐洲已上市的一個(gè)新型抗凝藥物,它對(duì)凝血酶直接性強(qiáng)抑制,導(dǎo)致凝血參數(shù)急劇升高,新蛭素（Neorudin,EH）與水蛭素相比具有良好的特異靶向性,降低水蛭素非特異性導(dǎo)致的全身出血副作用,然而EH是一條小分子短肽,分子量只有7.3 KD,易被腎小球過(guò)濾,經(jīng)尿液排出,使得EH在體內(nèi)半衰期較短,只有1-2 h,為獲得延長(zhǎng)重組新蛭素（EH）的半衰期的融合蛋白,本實(shí)驗(yàn)制備了通過(guò)連接肽連接的重組新蛭素與IgG1 Fc的融合蛋白（EH-L-Fc）,并對(duì)其進(jìn)行了功能分析。由于E.coli表達(dá)具有易操作、表達(dá)周期短等優(yōu)點(diǎn),真核表達(dá)系統(tǒng)具有對(duì)蛋白表達(dá)后修飾的優(yōu)勢(shì),本實(shí)驗(yàn)分別構(gòu)建原核、真核表達(dá)載體來(lái)獲得融合蛋白。方法:采用重疊PCR技術(shù)構(gòu)建pelB-eh-L-Fc/Eh-L-Fc融合基因,將pelB-eh-L-Fc克隆至表達(dá)載體pET-24a,Eh-L-Fc克隆至表達(dá)載體pcDNA3.1中,構(gòu)建真核和原核表達(dá)載體。分別利用... 

【文章來(lái)源】：青島科技大學(xué)山東省

【文章頁(yè)數(shù)】：84 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
符號(hào)說(shuō)明
第1章 緒論
    1.1 心腦血管疾病現(xiàn)況
        1.1.1 血栓性疾病概況
        1.1.2 血栓性疾病治療現(xiàn)狀
    1.2 水蛭素
        1.2.1 水蛭素的結(jié)構(gòu)功能
        1.2.2 凝血酶結(jié)構(gòu)與功能
        1.2.3 水蛭素的優(yōu)勢(shì)與弊端
        1.2.4 新蛭素
    1.3 融合蛋白類藥物
        1.3.1 蛋白藥物代謝
        1.3.2 融合蛋白類型
        1.3.3 PEG化修飾藥物
        1.3.4 Fc融合蛋白
            1.3.4.1 Fc融合蛋白簡(jiǎn)介
            1.3.4.2 FcRn介紹及其延長(zhǎng)半衰期的原理
            1.3.4.3 Fc的結(jié)合位點(diǎn)突變
            1.3.4.4 Fc融合蛋白的目前進(jìn)展
    1.4 融合蛋白連接短肽
        1.4.1 Linker的類型
        1.4.2 Linker的設(shè)計(jì)
    1.5 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與技術(shù)路線
        1.5.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
        1.5.2 技術(shù)路線
    1.6 研究目的與意義
第2章 不同連接肽pET-24a-pelB-eh-L-Fc的構(gòu)建及其在E.coli BL21中的表達(dá)
    2.1 材料與儀器
        2.1.1 主要材料
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 主要試劑配制
        2.1.5 實(shí)驗(yàn)所用序列
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 目的基因擴(kuò)增
        2.2.2 pET-24a-pelB-eh-L-Fc重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.2.2.1 雙酶切
            2.2.2.2 連接轉(zhuǎn)化
        2.2.3 重組表達(dá)載體pET-24a-pelB-eh-L-Fc的驗(yàn)證
            2.2.3.1 菌液PCR鑒定陽(yáng)性克隆
            2.2.3.2 雙酶切鑒定陽(yáng)性克隆
            2.2.3.3 送測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆
        2.2.4 重組pET-24a-pelB-eh-L-Fc質(zhì)粒在E.coli BL21中誘導(dǎo)表達(dá)
            2.2.4.1 重組pET-24a-pelB-eh-L-Fc載體搖瓶的表達(dá)條件優(yōu)化
            2.2.4.2 樣品處理
            2.2.4.3 目的蛋白的鑒定及表達(dá)方式的確定
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 PCR擴(kuò)增基因片段結(jié)果
        2.3.2 SOE-PCR獲得融合目的基因
        2.3.3 pET-24a-pelB-eh-L-Fc質(zhì)粒驗(yàn)證結(jié)果圖
        2.3.4 目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定
            2.3.4.1 IPTG對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響
            2.3.4.2 融合蛋白表達(dá)檢測(cè)
    2.4 討論
    2.5 本章結(jié)論
第3章 pcDNA3.1-Eh-L-Fc在CHO細(xì)胞中的表達(dá)、純化及活性分析
    3.1 材料與儀器
        3.1.1 主要材料
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器
        3.1.4 主要試劑配制
        3.1.5 實(shí)驗(yàn)所用序列
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 表達(dá)載體構(gòu)建
        3.2.2 CHO的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與篩選
            3.2.2.1 DMEM-F12培養(yǎng)基的配置
            3.2.2.2 CHO細(xì)胞復(fù)蘇
            3.2.2.3 細(xì)胞傳代
            3.2.2.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)與鋪孔板
            3.2.2.5 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞
            3.2.2.6 G418篩選濃度確定
            3.2.2.7 穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株的篩選
            3.2.2.8 細(xì)胞凍存
        3.2.3 蛋白表達(dá)檢測(cè)
            3.2.3.1 轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)蛋白表達(dá)
            3.2.3.2 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)
        3.2.4 融合蛋白的表達(dá)純化
        3.2.5 純化蛋白濃度與純度檢測(cè)
            3.2.5.1 純化蛋白濃度測(cè)定
            3.2.5.2 純化蛋白純度測(cè)定
        3.2.6 融合蛋白分子量測(cè)定
        3.2.7 體外活性檢測(cè)
            3.2.7.1 溶液的配制
            3.2.7.2 融合蛋白活性測(cè)定
            3.2.7.3 活性單位的定議和計(jì)算
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 目的基因的PCR擴(kuò)增
        3.3.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及驗(yàn)證
        3.3.3 轉(zhuǎn)錄水平（RT-PCR）檢測(cè)融合蛋白表達(dá)
        3.3.4 翻譯水平檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)
        3.3.5 穩(wěn)定性檢測(cè)
        3.3.6 EH-L-Fc蛋白的純化及檢測(cè)
        3.3.7 融合蛋白表達(dá)量比較
        3.3.8 生物活性檢測(cè)
    3.4 討論
    3.5 本章結(jié)論
第4章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號(hào)：2953246