心腦血管疾病是近年來威脅人類健康和生命的頭號殺手,血栓形成是許多心腦血管疾病的重要誘因,血栓一旦形成,往往形成不可逆的嚴重后果,抗凝劑是防治血栓形成的重要藥物。水蛭素（Hirudin,HV）是歐洲已上市的一個新型抗凝藥物,它對凝血酶直接性強抑制,導致凝血參數(shù)急劇升高,新蛭素（Neorudin,EH）與水蛭素相比具有良好的特異靶向性,降低水蛭素非特異性導致的全身出血副作用,然而EH是一條小分子短肽,分子量只有7.3 KD,易被腎小球過濾,經(jīng)尿液排出,使得EH在體內(nèi)半衰期較短,只有1-2 h,為獲得延長重組新蛭素（EH）的半衰期的融合蛋白,本實驗制備了通過連接肽連接的重組新蛭素與IgG1 Fc的融合蛋白（EH-L-Fc）,并對其進行了功能分析。由于E.coli表達具有易操作、表達周期短等優(yōu)點,真核表達系統(tǒng)具有對蛋白表達后修飾的優(yōu)勢,本實驗分別構(gòu)建原核、真核表達載體來獲得融合蛋白。方法:采用重疊PCR技術(shù)構(gòu)建pelB-eh-L-Fc/Eh-L-Fc融合基因,將pelB-eh-L-Fc克隆至表達載體pET-24a,Eh-L-Fc克隆至表達載體pcDNA3.1中,構(gòu)建真核和原核表達載體。分別利用... 

【文章來源】：青島科技大學山東省

【文章頁數(shù)】：84 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
符號說明
第1章 緒論
    1.1 心腦血管疾病現(xiàn)況
        1.1.1 血栓性疾病概況
        1.1.2 血栓性疾病治療現(xiàn)狀
    1.2 水蛭素
        1.2.1 水蛭素的結(jié)構(gòu)功能
        1.2.2 凝血酶結(jié)構(gòu)與功能
        1.2.3 水蛭素的優(yōu)勢與弊端
        1.2.4 新蛭素
    1.3 融合蛋白類藥物
        1.3.1 蛋白藥物代謝
        1.3.2 融合蛋白類型
        1.3.3 PEG化修飾藥物
        1.3.4 Fc融合蛋白
            1.3.4.1 Fc融合蛋白簡介
            1.3.4.2 FcRn介紹及其延長半衰期的原理
            1.3.4.3 Fc的結(jié)合位點突變
            1.3.4.4 Fc融合蛋白的目前進展
    1.4 融合蛋白連接短肽
        1.4.1 Linker的類型
        1.4.2 Linker的設計
    1.5 實驗設計與技術(shù)路線
        1.5.1 實驗設計
        1.5.2 技術(shù)路線
    1.6 研究目的與意義
第2章 不同連接肽pET-24a-pelB-eh-L-Fc的構(gòu)建及其在E.coli BL21中的表達
    2.1 材料與儀器
        2.1.1 主要材料
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 主要試劑配制
        2.1.5 實驗所用序列
    2.2 實驗方法
        2.2.1 目的基因擴增
        2.2.2 pET-24a-pelB-eh-L-Fc重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.2.2.1 雙酶切
            2.2.2.2 連接轉(zhuǎn)化
        2.2.3 重組表達載體pET-24a-pelB-eh-L-Fc的驗證
            2.2.3.1 菌液PCR鑒定陽性克隆
            2.2.3.2 雙酶切鑒定陽性克隆
            2.2.3.3 送測序鑒定陽性克隆
        2.2.4 重組pET-24a-pelB-eh-L-Fc質(zhì)粒在E.coli BL21中誘導表達
            2.2.4.1 重組pET-24a-pelB-eh-L-Fc載體搖瓶的表達條件優(yōu)化
            2.2.4.2 樣品處理
            2.2.4.3 目的蛋白的鑒定及表達方式的確定
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 PCR擴增基因片段結(jié)果
        2.3.2 SOE-PCR獲得融合目的基因
        2.3.3 pET-24a-pelB-eh-L-Fc質(zhì)粒驗證結(jié)果圖
        2.3.4 目的蛋白誘導表達及鑒定
            2.3.4.1 IPTG對菌體生長的影響
            2.3.4.2 融合蛋白表達檢測
    2.4 討論
    2.5 本章結(jié)論
第3章 pcDNA3.1-Eh-L-Fc在CHO細胞中的表達、純化及活性分析
    3.1 材料與儀器
        3.1.1 主要材料
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器
        3.1.4 主要試劑配制
        3.1.5 實驗所用序列
    3.2 實驗方法
        3.2.1 表達載體構(gòu)建
        3.2.2 CHO的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與篩選
            3.2.2.1 DMEM-F12培養(yǎng)基的配置
            3.2.2.2 CHO細胞復蘇
            3.2.2.3 細胞傳代
            3.2.2.4 細胞計數(shù)與鋪孔板
            3.2.2.5 瞬時轉(zhuǎn)染CHO細胞
            3.2.2.6 G418篩選濃度確定
            3.2.2.7 穩(wěn)定高表達細胞株的篩選
            3.2.2.8 細胞凍存
        3.2.3 蛋白表達檢測
            3.2.3.1 轉(zhuǎn)錄水平檢測蛋白表達
            3.2.3.2 Western Blot檢測蛋白表達
        3.2.4 融合蛋白的表達純化
        3.2.5 純化蛋白濃度與純度檢測
            3.2.5.1 純化蛋白濃度測定
            3.2.5.2 純化蛋白純度測定
        3.2.6 融合蛋白分子量測定
        3.2.7 體外活性檢測
            3.2.7.1 溶液的配制
            3.2.7.2 融合蛋白活性測定
            3.2.7.3 活性單位的定議和計算
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 目的基因的PCR擴增
        3.3.2 重組表達載體的構(gòu)建及驗證
        3.3.3 轉(zhuǎn)錄水平（RT-PCR）檢測融合蛋白表達
        3.3.4 翻譯水平檢測融合蛋白的表達
        3.3.5 穩(wěn)定性檢測
        3.3.6 EH-L-Fc蛋白的純化及檢測
        3.3.7 融合蛋白表達量比較
        3.3.8 生物活性檢測
    3.4 討論
    3.5 本章結(jié)論
第4章 結(jié)論
參考文獻
致謝
攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術(shù)論文


【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
[1]不同連接肽的TRAIL-Fc融合蛋白在E.coli中的重組表達及其活性研究[D]. 蔡曉娜.重慶理工大學 2014



本文編號：2953246