目的:尼帕病毒（Nipah virus,NiV）是高致死性的人畜共患病病毒,屬生物安全4級(jí)病原（BSL-4）,其主要疫區(qū)在東南亞,迄今尚無疫苗或治療藥物。本研究旨在建立安全、特異、高效的尼帕病毒進(jìn)入抑制劑體外藥效學(xué)評(píng)價(jià)模型。方法:采用假病毒技術(shù),以尼帕病毒表面糖蛋白G和融合蛋白F包裹HIV-luc核心構(gòu)建尼帕假病毒,用于感染尼帕病毒受體ephrin-B2高表達(dá)的HEK293T細(xì)胞,建立并優(yōu)化藥效學(xué)評(píng)價(jià)模型。結(jié)果:成功建立了可用于尼帕病毒進(jìn)入抑制劑活性評(píng)價(jià)的NiV-G-F/HIV-luc感染模型,經(jīng)工具藥驗(yàn)證(NiV-F-HR2融合肽,EC₅₀:0. 12μmol·L^-1)模型可用于化合物抗尼帕病毒藥效學(xué)評(píng)價(jià)。結(jié)論:本研究構(gòu)建的尼帕病毒進(jìn)入抑制劑藥效學(xué)評(píng)價(jià)模型特異性好、安全性高,可為抗尼帕病毒疫苗和藥物活性評(píng)價(jià)提供技術(shù)平臺(tái),對(duì)抗尼帕病毒藥物的研發(fā)有重要意義。 

【文章來源】：中國(guó)新藥雜志. 2020年08期 北大核心

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

用于構(gòu)建尼帕假病毒感染模型的質(zhì)粒

尼帕病毒以pH非依賴方式進(jìn)入宿主細(xì)胞，病毒表面糖蛋白G、融合蛋白F和宿主細(xì)胞表面ephrin-B2參與此過程[20]。在構(gòu)建Ni V-F和Ni V-G包裹HIV-luc核心假病毒時(shí)，細(xì)胞正確、高效表達(dá)病毒表面糖蛋白G及融合蛋白F是病毒包裝的前提，因此本研究首先對(duì)此進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，細(xì)胞轉(zhuǎn)染Ni V-G質(zhì)粒后，細(xì)胞中可檢測(cè)到Ni V-G，其大小約為72～75 kD，與野生病毒Ni V-G一致[25]，表明該蛋白已正確表達(dá)且被有效糖基化(見圖3A);細(xì)胞轉(zhuǎn)染Ni V-F質(zhì)粒后，細(xì)胞中可檢測(cè)到融合前體蛋白F0(～61 k D，見圖3A)及融合蛋白F1亞基(～49 k D，見圖3A)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[15,26]。Ephrin-B2是Ni V功能受體，細(xì)胞表面ephrin-B2高水平表達(dá)有利于Ni V的感染。因此，本研究構(gòu)建了高表達(dá)ephrin-B2的HEK293T細(xì)胞，并比較了HEK293T/ephrin-B2與野生型HEK293T細(xì)胞中ephrin-B2的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，HEK293T轉(zhuǎn)染pIRES2/ephrin-B2質(zhì)粒后，細(xì)胞中ephrin-B2表達(dá)水平顯著提高(見圖3B)。1.3構(gòu)建尼帕假病毒感染模型

Ni V為單股負(fù)鏈RNA病毒，病毒顆粒呈多形性，直徑為40～1 900 nm[1,18]。病毒基因組全長(zhǎng)18.2 kb，共編碼9個(gè)蛋白(L,G,F,M,P,N,V,W和C)。Ni V以p H非依賴方式進(jìn)入宿主細(xì)胞[1-2]，嵌在病毒膜上的糖蛋白(glycoprotein,G，見圖1A)和融合蛋白(fusion protein,F，見圖1C)參與了此過程，宿主細(xì)胞表面的ephrin-B2是Ni V功能受體[1]。Ni V-G由602個(gè)氨基酸編碼組成，包含7個(gè)N糖基化位點(diǎn)，其疏水性結(jié)構(gòu)域的9個(gè)氨基酸(L305,F458,W504,E505,Q530,T531,A532,E533,N557，見圖1B紅色)是與ephrin-B2結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基[1]。Ni V-F蛋白是含有546個(gè)氨基酸的Ⅰ型跨膜蛋白，由二硫鍵連接的F2和F1(包含疏水性融合肽、HR1、HR2、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū))2個(gè)活性亞基組成(見圖1C和1D)，在病毒表面以三聚體形式存在[19-20]。融合蛋白F0是無活性的前體蛋白，在被感染細(xì)胞中F0被合成后經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜，隨后在網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)下內(nèi)化，經(jīng)內(nèi)體組織蛋白酶L或組織蛋白酶B切割，生成具有融合活性的F2和F1亞基并運(yùn)至細(xì)胞膜外，其中F1亞基在病毒融合過程中發(fā)揮重要作用。尼帕病毒進(jìn)入宿主是病毒感染的第一步，阻斷病毒的進(jìn)入可有效抑制病毒感染。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]沙粒病毒進(jìn)入抑制劑體外藥效學(xué)評(píng)價(jià)模型的建立[J]. 張曉雨,唐克,郭家梅,陳勍,郭穎.  藥學(xué)學(xué)報(bào). 2018(05)
[2]尼帕病毒進(jìn)入抑制劑研究進(jìn)展[J]. 唐克,郭穎.  病毒學(xué)報(bào). 2017(05)
[3]絲狀病毒進(jìn)入抑制劑的細(xì)胞水平評(píng)價(jià)體系的建立[J]. 陳勍,郭穎.  藥學(xué)學(xué)報(bào). 2015(12)



本文編號(hào)：2933048