目的宮頸癌(Cervical cancer)是目前國內(nèi)婦科最常見的惡性腫瘤,嚴(yán)重影響了女性健康。它具有較強轉(zhuǎn)移性和預(yù)后復(fù)發(fā)率高等特點。目前臨床上多采取藥物治療作為保守療法,但隨著治療周期延長,極易產(chǎn)生耐藥性。因此,找出抑制耐藥恢復(fù)藥物敏感性的方法,從而對病情有效控制顯得尤為重要。宮頸癌細(xì)胞表面的P-糖蛋白(P-gp)表達(dá)水平遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞,且體內(nèi)P-gp含量高的宮頸癌患者更容易產(chǎn)生耐藥。這表明減少P-糖蛋白的過度表達(dá)可能成為克服宮頸癌耐藥的關(guān)鍵。MDR1是P-gp的編碼基因,因此靶向靜默MDR1將有效減少P-gp表達(dá)。吉非替尼(Gefitinib),是一種表皮生長因子受體酪氨酸激酶(EGFR-TK)抑制劑,在臨床上曾經(jīng)用于治療非小細(xì)胞癌,隨著對其性質(zhì)和藥理機制的深入研究,現(xiàn)在吉非替尼也被廣泛應(yīng)用于宮頸癌的治療,但是耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生嚴(yán)重限制了吉非替尼的抗腫瘤作用。因此本課題擬利用小干擾RNA即shMDR1對耐藥基因進(jìn)行靜默,減少P-gp的表達(dá),抑制耐藥的發(fā)生,使耐吉非替尼宮頸癌Hela細(xì)胞株重新獲得對吉非替尼的敏感性。本研究設(shè)計并制備殼聚糖納米粒將原料藥吉非替尼與shMDR1基因共同包裹于納米粒中,實現(xiàn)基因和抗腫瘤藥物的共傳遞�？疾旃草d納米粒的穩(wěn)定性及表征,分析共載納米粒對吉非替尼耐藥細(xì)胞株的增殖、凋亡作用影響,初步探究細(xì)胞對shMDR1和吉非替尼共載納米粒攝取機制。證明殼聚糖包載吉非替尼與shMDR1將具有克服腫瘤耐藥的潛質(zhì),增加化療效果。方法本實驗首先利用紫外吸收光度法建立吉非替尼的含量測定方法,并對方法的線性、重復(fù)性、穩(wěn)定性和回收率等進(jìn)行考察。采用離子交聯(lián)法將吉非替尼與shMDR1共包載于材料殼聚糖中,制備成殼聚糖納米粒。對制備的共載納米粒進(jìn)行表征分析,包括外觀、形態(tài)、粒徑,同時對納米粒的體外釋放度及長期穩(wěn)定性進(jìn)行考察。通過凝膠阻滯、血清保護實驗和酶解實驗考察殼聚糖對所包裹質(zhì)粒shMDR1的保護作用。激光共聚焦顯微鏡觀察shMDR1與吉非替尼共載納米粒在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。通過攝取實驗分析細(xì)胞攝取共載納米粒方式。對共載納米粒的體外抗腫瘤活性進(jìn)行考察。運用MTT法初步探究shMDR1與吉非替尼共載納米粒對宮頸癌細(xì)胞增殖作用影響。流式細(xì)胞術(shù)分析shMDR1與吉非替尼共載納米粒對細(xì)胞凋亡影響。Western blot實驗檢測共載納米粒對細(xì)胞凋亡和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果建立的吉非替尼原料藥shMDR1含量測定方法線性、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和回收率均符合方法學(xué)要求,故測定方法可用于吉非替尼與shMDR1的體外含量測定。篩選出制備shMDR1與吉非替尼共載納米粒的最佳處方,所制備的納米粒大小均勻,透射電鏡觀察納米粒的形態(tài)呈緊致球形,分散性良好。包封率結(jié)果顯示所選擇的處方能夠很好的將兩者包封于納米粒中。吉非替尼包封率為89.8%±7.1%,shMDR1為88.3%±7.2%。共載殼聚糖納米粒的釋放呈現(xiàn)pH依賴性,在pH為5.8條件下吉非替尼迅速釋放,但在pH為7.4條件下釋放緩慢,shMDR1在納米粒中的釋放行為與吉非替尼相比沒有顯著差異,在48 h時shMDR1在兩種pH條件下的累計釋放率均約為75%,體現(xiàn)兩者均能從納米粒中很好的釋放到緩沖液。激光共聚焦顯微鏡觀察到共載殼聚糖納米粒能夠富集到細(xì)胞核周圍,且富集行為呈時間和劑量依賴性。攝取實驗?zāi)軌蜃C明細(xì)胞對共載納米粒的攝取與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)作用相關(guān),通過加入多種抑制劑初步揭示納米粒在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運呈能量依賴性。MTT與流式結(jié)果分析顯示shMDR1與吉非替尼共載納米粒能夠抑制宮頸癌細(xì)胞增殖,具有較強的細(xì)胞毒性,能夠誘導(dǎo)細(xì)胞顯著增加凋亡。Western blot實驗結(jié)果表明共載殼聚糖納米粒能顯著增加細(xì)胞Cleaved caspase-3的表達(dá),同時遞送的shMDR1能夠減少MDR1的含量,證明共載納米粒能夠逆轉(zhuǎn)MDR1介導(dǎo)的耐藥機制。結(jié)論本研究成功制備了共載shMDR1與吉非替尼的殼聚糖納米粒,所制備的共載納米粒具有大小均勻,形態(tài)呈球形,分散性良好,呈pH依賴性釋放的特點。殼聚糖作為本文的納米載體能夠有效保護質(zhì)粒與藥物在血清、酶存在環(huán)境下避免被降解。共載納米粒對耐吉非替尼的Hela細(xì)胞有明顯的抑制增殖作用,其機制是shMDR1進(jìn)入細(xì)胞后,阻斷耐藥基因MDR1的表達(dá),導(dǎo)致P-gp表達(dá)減少,逆轉(zhuǎn)耐藥,使耐藥細(xì)胞株Hela恢復(fù)對吉非替尼的敏感性,這將有利于在不遠(yuǎn)的未來,納米技術(shù)應(yīng)用于基因工程發(fā)揮更大的作用,創(chuàng)造更多的價值。
【學(xué)位單位】：錦州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R96
【部分圖文】：

吉非替尼紫外可見光譜掃描圖

圖 1B 殼聚糖紫外可見光譜掃描圖非替尼標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 結(jié)果所示，X 軸是吉非替尼標(biāo)準(zhǔn)品濃度 C，Y 軸是吸光度繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程 A=0.0212C+0.023，相

可以排除其對吉非替尼含量測定的干擾。圖 1A 吉非替尼紫外可見光譜掃描圖圖 1B 殼聚糖紫外可見光譜掃描圖2、吉非替尼標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制如圖 2 結(jié)果所示，X 軸是吉非替尼標(biāo)準(zhǔn)品濃度 C，Y 軸是吸光度 A，根據(jù)所得檢測結(jié)果繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程 A=0.0212C+0.023，相關(guān)系數(shù) r＝0.9991，說明吉非替尼質(zhì)量濃度在 1～50 μg/mL 內(nèi)線性關(guān)系良好。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2890269