目的1、明確炎性因子TNF-α是否具有影響3T3-L1脂肪細(xì)胞中PPARγ磷酸化修飾的作用。2、明確替米沙坦是否能拮抗TNF-α對PPARγ的影響。3、明確替米沙坦對脂肪細(xì)胞的作用是否確系依賴于蛋白激酶CDK5的活性及替米沙坦的作用位點。方法三步法誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞不斷分化成為成熟脂肪細(xì)胞,腫瘤壞死因子α(Tumour necrosis factor-α,TNF-α)刺激成熟3T3-L1,以替米沙坦不同劑量進行分組干預(yù)(T0.1組,加入0.1μmol/L替米沙坦;T5組,加入5μmol/L替米沙坦;T10組加入10μmol/L替米沙坦;),蛋白免疫印跡(Western Blot,WB)檢測過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptorγ,PPARγ)及其磷酸化水平。應(yīng)用shRNA沉默未分化3T3-L1的PPARγ,應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染構(gòu)建并篩選穩(wěn)定表達PPARγ絲氨酸突變型3T3-L1細(xì)胞系,油紅O染色異丙醇萃取實驗評估脂肪細(xì)胞分化能力,WB檢測確定其磷酸化位點及其上游激酶。shRNA沉默細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶5(Cyclin-dependent kinase 5,CDK5),并以替米沙坦干預(yù)成熟3T3-L1,WB檢測PPARγ及其磷酸化水平,ELISA檢測培養(yǎng)基上清中脂聯(lián)素釋放量。結(jié)果1、三步法可成功建立3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化模型,篩選的PPARγ各突變型細(xì)胞與野生型相比分化能力相當(dāng)。2、替米沙坦影響PPARγ在3T3-L1中的磷酸化修飾,以不同劑量替米沙坦干預(yù)24h后各組pPPARγ表達水平均有所降低,其中T5及T10組降低顯著,脂聯(lián)素含量顯著上升。3、western印跡結(jié)果顯示與WT相比僅S273A細(xì)胞中PPARγ的磷酸化水平不再響應(yīng)替米沙坦干預(yù),即未見pPPARγ表達量降低,而S112A、S186A中pPPARγ表達量均下降。4、CDK5介導(dǎo)了替米沙坦對PPARγS273位磷酸化的抑制,沉默CDK5基因并篩選ΔCDK5-3T3-L1前脂肪細(xì)胞系(沉默CDK5的3T3-L1前脂肪細(xì)胞系),上述細(xì)胞誘導(dǎo)成熟后油紅O染色結(jié)果表明:CDK5基因沉默后3T3-L1分化能力未受顯著影響,但與對照組相比ΔCDK5-3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞中替米沙坦降低PPARγ磷酸化水平的能力被顯著抑制,與此同時培養(yǎng)基上清中脂聯(lián)素表達顯著升高。結(jié)論1、TNF-α刺激3T3-L1脂肪細(xì)胞導(dǎo)致的脂聯(lián)素釋放量下降是通過上調(diào)PPARγ磷酸化修飾水平進而影響其轉(zhuǎn)錄活性而非增加PPARγ表達水平實現(xiàn)的。替米沙坦可拮抗上述TNF-α作用。2、利用逆轉(zhuǎn)錄病毒進行基因沉默及定點突變技術(shù)成功構(gòu)建一系列PPARγ磷酸化位點突變的3T3-L1細(xì)胞株。利用該細(xì)胞株確定替米沙坦的作用位點為第273位絲氨酸。3、按上述方法沉默CDK5基因并篩選ΔCDK5-3T3-L1前脂肪細(xì)胞系,CDK5基因沉默后3T3-L1分化能力未受顯著影響但替米沙坦降低PPARγ磷酸化水平的能力被顯著抑制。4、替米沙坦可抑制CDK5介導(dǎo)的PPARγ第273位絲氨酸磷酸化,從而上調(diào)脂聯(lián)素表達水平,具有改善胰島素抵抗作用,對替米沙坦改善炎癥反應(yīng)分子機制的明確,可以為此類藥物早日應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù),填補目前T2DM藥物預(yù)防領(lǐng)域的空白。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R96
【部分圖文】：

15圖 1 3T3-L1 前脂肪細(xì)胞正常分化各階段細(xì)胞形態(tài)（200X）A：前脂肪細(xì)胞；B：接觸抑制 48h；C：分化第 2 天；D：分化第 4 天；E：分化第 6 天；F：分化第 8 天Fig1. 3T3-L1 preadipocytes normal differentiation at various stages of cell morphology （200X）A：Preadipocytes; B：Contact inhibition 48h; C：Differentiation day 2; D：Differentiation day 4; E：Differentiationday 6; F：Differentiation day 8

PPAR-γ 的磷酸化修飾胞誘導(dǎo)分化成熟時加入 TNF止干預(yù)，收獲脂肪細(xì)胞并檢測estern 印跡結(jié)果顯示，TNF-α 磷酸化修飾，且在誘導(dǎo) 30m峰值，隨后磷酸化水平有所下NF-α0 15 30 60 120（minpPP

于 60min 達到峰值，隨后磷酸化水平有所下降，見圖 2圖 2 TNFα 誘導(dǎo)不同時間對 PPARγ 磷酸化的影響Fig2. TNFα-induced PPARγ phosphorylation at different times米沙坦影響 PPARγ 在 3T3-L1 中的磷酸化修飾estern 印跡結(jié)果顯示，成熟的 3T3-L1 中加入 TNF-α 刺激達未見顯著變化，PPARγ 磷酸化水平明顯增強。以不同 后各組 pPPARγ 表達水平均有所降低，其中 T5 及 T10 組顯著上升，見圖 3。TNF-α0 15 30 60 120（min）PPARγpPPARγ
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本文編號：2888550