【摘要】：目的本研究探討甲基苯丙胺通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)通路導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。方法:構(gòu)建人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SH-SY5Y和SD大鼠構(gòu)建了甲基苯丙胺暴露模型。在兩種模型中,應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)分別在體外和體內(nèi)檢測(cè)觀察到甲基苯丙胺暴露引起兩種磷酸化Tau蛋白(絲氨酸396位點(diǎn)和蘇氨酸231位點(diǎn))表達(dá)量的變化情況;應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色和免疫熒光染色,分別觀察了兩種甲基苯丙胺暴露模型磷酸化Tau蛋白的表達(dá)及分布情況;利用小干擾RNA技術(shù)和病毒感染技術(shù)分別對(duì)磷酸化Tau蛋白的上游調(diào)控因子CDK5進(jìn)行敲減,觀察磷酸化Tau蛋白表達(dá)的變化情況以及泛素化蛋白、蛋白酶體降解途徑底物之一的CD3-δ的表達(dá)情況。觀察甲基苯丙胺暴露對(duì)泛素依賴的蛋白酶體降解途徑的影響。檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)分子磷酸化PERK以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性凋亡信號(hào)分子Caspase-12的表達(dá)情況。以及敲減CDK5后,上述兩種蛋白在兩種暴露模型中的表達(dá)變化情況。結(jié)果:1.甲基苯丙胺暴露在體內(nèi)和體外均可以引起磷酸化Tau蛋白表達(dá)的明顯上調(diào)(P0.05);2.敲減CDK5可以抑制甲基苯丙胺暴露誘導(dǎo)的磷酸化Tau表達(dá)上調(diào)(P0.05);3.甲基苯丙胺暴露對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性降解的影響:與對(duì)照組相比,甲基苯丙胺使泛素化蛋白和CD3-δ的表達(dá)量顯著增加(P0.05),當(dāng)敲減CDK5之后,由甲基苯丙胺暴露引起泛素化蛋白和CD3-δ的表達(dá)顯著被抑制(P0.05);4.甲基苯丙胺暴露誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡:與對(duì)照組相比,甲基苯丙胺暴露可以導(dǎo)致pPERK和Caspase-12表達(dá)顯著升高(P0.05),而敲減CDK5之后,這種增高的趨勢(shì)明顯被抑制(P0.05);在SH-SY5Y細(xì)胞甲基苯丙胺暴露模型中,對(duì)照組和單獨(dú)敲減CDK5兩組中,神經(jīng)細(xì)胞凋亡率都在較低水平且無(wú)顯著差異(總凋亡率:3.60 ±1.05%vs.3.73± 0.55%,P0.05);而敲減CDK5同時(shí)又給予甲基苯丙胺暴露可以引起細(xì)胞凋亡率較單獨(dú)甲基苯丙胺暴露有顯著下降(總凋亡率:18.70 ±3.91%vs.9.96± 1.20%,p0.01)結(jié)論:甲基苯丙胺暴露增加了磷酸化Tau蛋白的水平。而異常的Tau蛋白增多并堆積會(huì)破壞清除泛素化蛋白質(zhì)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解途徑,阻礙泛素依賴的蛋白酶體降解途徑,進(jìn)而引發(fā)非折疊蛋白反應(yīng)并激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而誘導(dǎo)神經(jīng)元的凋亡。然而,敲減CDK5可以抑制過(guò)表達(dá)的磷酸化Tau,恢復(fù)受損的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解途徑,然后減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,啟到保護(hù)神經(jīng)元的作用。這些結(jié)果表明,甲基苯丙胺誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡與Tau蛋白過(guò)度磷酸化密切相關(guān),可以通過(guò)敲除CDK5逆轉(zhuǎn)甲基苯丙胺的神經(jīng)毒性作用。通過(guò)上述研究結(jié)果,我們?yōu)橐訡DK5為靶點(diǎn),通過(guò)抑制磷酸化Tau蛋白的異常表達(dá),減弱甲基苯丙胺的促凋亡作用,以及為甲基苯丙胺神經(jīng)毒性的分子機(jī)制提供了新的理論基礎(chǔ)和研究思路。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R99
【圖文】：

邐博士學(xué)位論文邐逡逑ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細(xì)胞分別設(shè)置甲基苯丙胺暴露的濃度梯度（０，邋０．５，邋１．０，１．５，邋２．０ｍＭ）逡逑和時(shí)間梯度（０，邋２，邋４，邋８，１６，邋２４小時(shí)）。對(duì)照組以等量的生理鹽水代替甲基苯逡逑丙胺。用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)（Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ）檢測(cè)磷酸化Ｔａｕ邋（磷酸化Ｔａｕ邋Ｓｅｒ３９６逡逑和磷酸化ＴａｕＴｈｒ２３１）表達(dá)的情況。結(jié)果顯示，在ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細(xì)胞甲基苯丙胺暴逡逑露模型中，磷酸化ＴａｕＳｅｒ３９６和磺酸化ＴａｕＴｈｒ２３１的表達(dá)明顯增加，并呈劑量逡逑依賴和時(shí)間依賴的特點(diǎn)（圖１－１）。逡逑Ｆｉｇ．邋１逡逑Ｂ邐Ｃ逡逑，１．１２．ｍｍ

ｂｌｏｔ結(jié)果，我們選擇最適的甲基苯丙胺暴露濃度２ｍＭ和最適暴露時(shí)間２４小時(shí)為逡逑本實(shí)驗(yàn)的暴露條件。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，甲基苯丙胺暴露組的磷酸化Ｔａｕ逡逑Ｓｅｒ３９６和磷酸化Ｔａｕ邋Ｔｈｒ２３１的表達(dá)量都有明顯增高（圖１－２）。藍(lán)色顆粒顯示為逡逑細(xì)胞核，綠色顆粒代表磷酸化Ｔａｕ陽(yáng)性顆粒。可見，在甲基苯丙胺暴露可以使磷逡逑酸化Ｔａｕ在胞質(zhì)內(nèi)增多并聚集。逡逑W國(guó)逡逑圖１－２邋ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細(xì)胞甲基苯丙胺暴露模型磷酸化Ｔａｕ蛋白表達(dá)情況免疫熒光染色。藍(lán)色顆逡逑．粒顯示細(xì)胞核，綠色顯示磷酸化Ｔａｕ陽(yáng)性顆粒。逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ邋ｔａｕ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｉｎ邋ＳＨ－ＳＹ５Ｙ邋ｃｅｌｌｓ邋ｅｘｐｏｓｅｄ邋ｔｏ逡逑ｍｅｔｈａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ邋ｗａｓ邋ｄｅｔｅｃｔｅｄ邋ｂｙ邋ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ．邋Ｔｈｅ邋ｂｌｕｅ邋ｇｒａｎｕｌｅｓ邋ｓｈｏｗｅｄ邋ｔｈｅ逡逑ｎｕｃｌｅｕｓ邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｇｒｅｅｎ邋ｃｅｌｌｓ邋ｓｈｏｗｅｄ邋ｔｈｅ邋ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ邋ｔａｕ邋ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｇｒａｎｕｌｅｓ．逡逑第二節(jié)磷酸化Ｔａｕ蛋白在ＳＤ大鼠甲基苯丙胺暴露模型中的表達(dá)逡逑ＳＤ大鼠為大鼠（ｒａｔ；邋ｒａｔｔｕｓ邋ｎｏｒｒｅｇｉｃｕｓ）的一個(gè)品系，１９２５年，美國(guó)斯?jié)娎坼义细�？多雷（ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ）農(nóng)場(chǎng)用Ｗｉｓｔａｒ大鼠培育而成。其毛色白化。廣泛用于逡逑藥理、毒理、藥效等方面的研究，也常用于研宄、評(píng)價(jià)和確定最大給藥量、劑逡逑量反應(yīng)和代謝以及服藥后的臨床和組織學(xué)檢查。另外

藍(lán)色顆粒顯示細(xì)胞核；紅色為神經(jīng)元標(biāo)志物ＮｅｕＮ陽(yáng)性顆粒，顯示神經(jīng)逡逑元；綠色為磷酸化Ｔａｕ陽(yáng)性顆粒，分布于胞質(zhì)中。與對(duì)照組相比，甲基苯丙胺暴逡逑露組（１４天）兩種磷酸化Ｔａｕ的表達(dá)均聚集增多（圖１－４）。在免疫組化染色中，逡逑４７逡逑

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

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本文編號(hào)：2805680