【摘要】：目的骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis)是一種常見的以關(guān)節(jié)軟骨退行性病變?yōu)樘攸c的疾病。治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物中,玻璃酸鈉(sodium hyaluronate,SH)因其療效明確、副作用少而在臨床中受到高度認可,然而,由于SH在關(guān)節(jié)腔中降解較快,故需給藥頻次過高,給治療帶來了不便。黃原膠由于其獨特的性質(zhì)在彌補SH易降解的缺點并具備SH治療骨關(guān)節(jié)炎藥理作用方面顯示了代替SH成為治療骨關(guān)節(jié)炎的候選藥物的潛力。我們課題組研究證明了分子量為3×10~6 Da~5×10~6 Da的黃原膠可在實驗性骨關(guān)節(jié)炎模型中有效地抑制關(guān)節(jié)軟骨的降解。然而多糖類藥物的分子量與其療效密切相關(guān),故我們需進一步評價不同分子量的黃原膠在實驗性骨關(guān)節(jié)炎中的治療作用。前期我們證明了低分子黃原膠(1.0×10~6 Da~1.5×10~6Da)(lower range of molecular weight of xanthan gum,LRWXG)對氧化應(yīng)激條件下的軟骨細胞具有保護作用,但其作用機制尚不明確。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信號通路與軟骨細胞凋亡密切相關(guān)。本實驗旨在通過對兔軟骨細胞MAPKs信號通路相關(guān)物質(zhì)表達的測定,闡明低分子量黃原膠治療骨關(guān)節(jié)炎的MAPKs信號通路機制。方法采用多角度激光散射法測定黃原膠的分子量;根據(jù)2015版《中國藥典》,采用槐豆膠實驗和紅外吸收光譜法對黃原膠進行鑒定。采用Cell Counting Kit-8(CCK-8試劑盒)檢測低分子量黃原膠對體外培養(yǎng)的分離于4周齡大小的新西蘭大耳白兔軟骨細胞生長與增殖的影響。設(shè)置黃原膠濃度梯度(0,10,100,500,1 000,2 000μg/mL),用含不同濃度的黃原膠的培養(yǎng)液對體外培養(yǎng)的軟骨細胞進行培養(yǎng)。采用CCK-8對所處理的細胞的細胞活力進行檢測。設(shè)計分組,包括模型組、LRWXG濃度梯度組(0,10,100,500,1 000μg/mL)、信號通路抑制劑組(SP600125,SB203580)和信號通路抑制劑加LRWXG(1 000μg/mL)組。其中SP600125和SB203580為JNK和p-38信號通路抑制劑,可以特異性阻斷JNK和p-38蛋白的磷酸化進而阻斷相應(yīng)信號通路的激活。LRWXG分組干預(yù)24 h后,向除空白組以外的其他各組加入H_2O_2溶液,使最終濃度為0.5 mM,處理24 h,建立細胞凋亡模型。采用CCK-8檢測培養(yǎng)細胞的存活率;采用酶聯(lián)免疫吸附法(Elisa)測定細胞內(nèi)腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)、環(huán)氧化酶2(COX-2)、前列腺素E2水平(PGE2)的水平;采用蛋白質(zhì)印跡(Western blot)檢測MAPKs信號通路相關(guān)蛋白p38、p-p38、JNK、p-JNK、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3的表達水平;采用免疫熒光法檢測細胞內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)家族成員MMP-1、MMP-13和膠原蛋白家族成員Ⅱ型膠原蛋白(COLII)的表達。結(jié)果1.樣品分子量1.0×10~6 Da~1.5×10~6 Da。經(jīng)別實驗與紅外光譜圖比對,證明了純化的樣品為黃原膠。2.細胞增殖實驗顯示,低分子量黃原膠(10,100,500,1 000,2 000μg/mL)處理的軟骨細胞的細胞活力與空白對照組沒有顯著性差別,說明黃原膠不會影響軟骨細胞的正常生長與增值。3.CCK-8細胞活力檢測結(jié)果顯示,與Model組相比,LRWXG(500μg/mL)可提高軟骨細胞的存活率(P0.05),LRWXG(1 000μg/mL)可明顯提高軟骨細胞的存活率(P0.01);與單獨加抑制劑(SP600125、SB203580、SP600125+SB203580)相比,LRWXG(1 000μg/mL)加抑制劑(SP600125、SB203580、SP600125+SB203580)可明顯提高軟骨細胞的存活率(P0.01)。實驗結(jié)果顯示,LRWXG的抗凋亡作用呈現(xiàn)劑量依賴性,且LRWXG抗凋亡作用明顯強于信號通路抑制劑。4.ELISA檢測結(jié)果顯示,與陰性對照組相比,H_2O_2能夠明顯地增加炎性因子IL-1β、TNF-α、COX-2、PGE2的水平(P0.01)。與Model組相比,LRWXG能夠降低炎性因子的水平且呈劑量依賴性;除PGE2外,其他三種炎性因子在加抑制劑組中的水平與Model組無顯著性差別(P0.05);而LRWXG加抑制劑組四種炎性因子水平低于(P0.05)或明顯低于(P0.01)單獨加抑制劑組或Model組。實驗結(jié)果表明LRWXG對炎性因子的抑制作用強于MAPKs信號通路抑制劑。5.Western blot結(jié)果顯示,與Model組相比,LRWXG可顯著降低促凋亡蛋白p-p38、p-JNK、Bax、cleaved-caspase-3的表達水平,提高抑凋亡蛋白Bcl-2的表達水平,且該作用呈劑量依賴性;與單獨加信號通路抑制劑組相比,同時加信號通路抑制劑和LRWXG(1 000μg/mL)組p-p38和p-JNK蛋白表達水平無顯著性差異(P0.05),促凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase-3的表達水平明顯降低,抑凋亡蛋白Bcl-2的表達水平明顯增加(P0.01)。實驗結(jié)果顯示,LRWXG對MAPKs信號通路蛋白抑制作用與信號通路抑制劑相同,對凋亡末端相關(guān)蛋白的抑制或促表達作用強于信號通路抑制劑。6.免疫熒光染色結(jié)果顯示,與Model組相比,LRWXG能夠抑制MMP-1和MMP-13的表達并增加COLII的表達,且該作用呈劑量依賴性;同樣與Model組相比,單獨加抑制劑組三種蛋白的表達水平并表現(xiàn)為:MMP-1和MMP-13的表達水平有所下降,COLII的表達水平有所升高,但是變化不明顯(P0.05)。與單獨加抑制劑組相比,LRWXG加抑制劑組MMP-1和MMP-13的表達有明顯的下降,COLII的表達水平有明顯升高(P0.01)。這些結(jié)果提示LRWXG加抑制劑對MMPs的抑制作用和對COLII的保護作用均強于MAPKs信號通路抑制劑。結(jié)論LRWXG可以通過MAPKs凋亡相關(guān)信號通路發(fā)揮作用,起到抗凋亡、保護軟骨細胞的作用。
【學(xué)位授予單位】：錦州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R965
【圖文】：

性狀觀察實驗

23圖 2 溶解實驗 槐豆膠實驗實驗結(jié)果中觀察到，樣品與槐豆膠混合組放冷后形成橡膠而單獨加樣品組放冷后不形成橡膠狀凝膠物，仍然是膠狀結(jié)果與《中國藥典》2015 年版中關(guān)于 XG 的鑒別實驗中規(guī)

槐豆膠實驗

【參考文獻】

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本文編號：2794853