【摘要】：惡性腫瘤是全球主要的致死疾病之一,嚴(yán)重威脅人類的健康。惡性腫瘤的臨床治療手段仍以手術(shù)和化療為主。但化療藥物通常具有溶解性差、毒性大、不具有靶向性等缺點(diǎn),限制其廣泛的臨床應(yīng)用。本文建立了一種細(xì)胞穿膜肽(CPP)修飾的自包封前體藥物及其共遞送體系用于遞送難溶性化療藥物。7-乙基-10-羥基喜樹堿(SN38)是一種傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物,具有廣譜的抗腫瘤活性,但由于自身的理化性質(zhì)、藥理學(xué)特點(diǎn)和毒性限制,使其很難應(yīng)用于腫瘤的臨床治療。本文以SN38作為模型藥物,采用PEG與不同性質(zhì)的CPP修飾SN38合成SN38前體藥物(CPP-PEG-SN38)改善其溶解性、提高細(xì)胞攝取。這些SN38前體藥物可以自組裝形成膠束,聚乙二醇(PEG)對(duì)CPP的電荷屏蔽作用使這些膠束可以應(yīng)用于體內(nèi)抗腫瘤研究。與陽(yáng)性對(duì)照伊立替康(CPT-11)相比,這些CPP-PEG-SN38膠束在細(xì)胞攝取、體內(nèi)體外抗腫瘤活性、組織分布等方面具有顯著的優(yōu)勢(shì),并且優(yōu)化出具有最優(yōu)抗腫瘤活性的前體藥物(TAT-PEG-SN38)。但CPP-PEG-SN38并未改善CPT-11對(duì)組織的毒性。Survivin siRNA可以提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性,為增強(qiáng)SN38靶向性、改善SN38抗腫瘤活性、降低SN38的組織毒性,本文建立了TAT-PEG-SN38與survivin siRNA的轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)靶向脂質(zhì)體共遞送體系(Tf-L-SN38/P/siRNA)。Survivin siRNA與魚精蛋白通過(guò)靜電吸附構(gòu)成脂質(zhì)體核心;磷脂與TAT-PEG-SN38作為遞送體系的中間層骨架;外層的Tf修飾為脂質(zhì)體提供靶向能力。Tf-L-SN38/P/siRNA提高了survivin siRNA與TAT-PEG-SN38的抗腫瘤活性,并且與CPT-11相比,顯著降低了組織毒性。本論文研究?jī)?nèi)容主要涉及以下幾部分:1、CPP-PEG-SN38合成以PEG作為linker連接CPP與SN38,合成一系列CPP-PEG-SN38。采用三步法合成CPP-PEG-SN38:(1)合成5種C末端半胱氨酸修飾的CPP,5種CPP分別為R8、P28、PFV、SAP(E)和TAT。(2)以三光氣作為酰氯化試劑,將SN38的C_(10)位羥基酰氯化后,與OPSS-PEG_(2000)-OH通過(guò)酯鍵連接。(3)反應(yīng)產(chǎn)物中加入半胱氨酸修飾的CPP與OPSS基團(tuán)反應(yīng)形成二硫鍵,合成CPP-PEG-SN38。CPP-PEG-SN38自組裝形成膠束,粒徑為124 nm到249 nm,并具有相對(duì)較低的電位。2、CPP-PEG-SN38體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià)通過(guò)激光共聚焦與流式細(xì)胞儀對(duì)CPP-PEG-SN38的細(xì)胞攝取定性、定量分析,CPP-PEG-SN38可以被細(xì)胞完整地?cái)z取,CPP-PEG-SN38的細(xì)胞攝取依賴CPP的疏水性與正電荷,TAT-PEG-SN38具有最高的細(xì)胞攝取率,并且具有細(xì)胞核靶向性。采用細(xì)胞攝取抑制劑處理細(xì)胞,研究不同CPP-PEG-SN38的攝取機(jī)制,發(fā)現(xiàn)CPP-PEG-SN38主要通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞。CPP-PEG-SN38的體外抗腫瘤活性與CPP的性質(zhì)密切相關(guān),CPP-PEG-SN38的細(xì)胞毒性與細(xì)胞攝取具有相似的趨勢(shì),并且CPP-PEG-SN38的細(xì)胞毒性具有時(shí)間、劑量依賴特性。在A549和MCF-7細(xì)胞中,TAT-PEG-SN38的細(xì)胞毒性分別為SN38的4.3、3.6倍。3、CPP-PEG-SN38體內(nèi)抗腫瘤活性及毒性研究通過(guò)體外溶血實(shí)驗(yàn)對(duì)CPP-PEG-SN38的血液相容性進(jìn)行分析,CPP-PEG-SN38并未引起溶血或者凝聚現(xiàn)象,可以通過(guò)靜脈給藥。建立裸鼠A459細(xì)胞異位荷瘤模型評(píng)價(jià)CPP-PEG-SN38體內(nèi)抗腫瘤活性,系列CPP-PEG-SN38膠束均具有顯著的抗腫瘤活性,TAT-PEG-SN38展現(xiàn)了最強(qiáng)的腫瘤生長(zhǎng)抑制效果。與對(duì)照組和CPT-11給藥組相比,TAT-PEG-SN38分別抑制73.6%和61.4%的腫瘤生長(zhǎng)。體外、體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)證明:TAT-PEG-SN38具有最優(yōu)的抗腫瘤活性。通過(guò)體重、臟器病理切片評(píng)價(jià)CPP-PEG-SN38的毒性。TAT-PEG-SN38的毒性與CPT-11相似,并未顯著降低裸鼠體重。但臟器病理切片顯示TAT-PEG-SN38會(huì)對(duì)裸鼠的肝臟、小腸造成損傷,損傷程度和CPT-11相近。4、TAT-PEG-SN38的藥代動(dòng)力學(xué)及組織分布建立血漿、組織中TAT-PEG-SN38、SN38和CPT-11的含量分析方法,研究大鼠給藥TAT-PEG-SN38和CPT-11后的藥代動(dòng)力學(xué),CPT-11的血藥濃度顯著高于TAT-PEG-SN38,TAT-PEG-SN38并未展現(xiàn)出抗腫瘤優(yōu)勢(shì)。建立裸鼠A549細(xì)胞荷瘤模型,分析TAT-PEG-SN38在裸鼠體內(nèi)的組織分布。TAT-PEG-SN38在裸鼠腫瘤內(nèi)大量積累,在腫瘤組織內(nèi)TAT-PEG-SN38的AUC_(last)是CPT-11的37.5倍,TAT-PEG-SN38釋放的游離SN38的AUC_(last)是CPT-11的8.7倍。通過(guò)裸鼠活體成像進(jìn)一步分析TAT對(duì)TAT-PEG-SN38在腫瘤內(nèi)累積的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明:TAT可以促進(jìn)SN38在腫瘤組織內(nèi)累積,發(fā)揮更好的抗腫瘤活性。5、Tf-L-SN38/P/siRNA抗腫瘤活性評(píng)價(jià)SN38是一種具有廣譜抗腫瘤活性的拓?fù)洚悩?gòu)酶I(TOPⅠ)抑制劑。然而SN38具有溶解性差、副作用強(qiáng)等缺點(diǎn),雖然將SN38合成TAT-PEG-SN38前體藥物提高了抗腫瘤活性,但與CPT-11相比并未顯著改善組織毒性。Survivin在腫瘤細(xì)胞高表達(dá),survivin蛋白具有抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)血管生成等作用。Survivin siRNA可以提高腫瘤細(xì)胞對(duì)SN38的敏感性,增強(qiáng)SN38的抗腫瘤活性。本文建立了共遞送survivin siRNA與TAT-PEG-SN38的靶向脂質(zhì)體體系,以期提高TAT-PEG-SN38的抗腫瘤活性、降低組織毒性。Tf-L-SN38/P/siRNA的粒徑為148 nm,ζ-電位為+7.8 mV。當(dāng)魚精蛋白與survivin siRNA通過(guò)靜電吸附形成脂質(zhì)體核心時(shí),脂質(zhì)體具有更好的siRNA結(jié)合效率。Tf-L-SN38/P/siRNA可以將survivin siRNA與TAT-PEG-SN38同步地、等比例地轉(zhuǎn)載進(jìn)入細(xì)胞,并且Tf與TAT-PEG-SN38顯著增強(qiáng)了Tf-L-SN38/P/siRNA的細(xì)胞攝取。細(xì)胞攝取機(jī)制研究結(jié)果顯示,Tf-L-SN38/P/siRNA主要通過(guò)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞。MTT實(shí)驗(yàn)中,survivin siRNA脂質(zhì)體對(duì)HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒性不顯著。在HeLa細(xì)胞中,Tf脂質(zhì)體僅載藥TAT-PEG-SN38時(shí),細(xì)胞毒性是SN38的1.25倍;但當(dāng)survivin siRNA與TAT-PEG-SN38聯(lián)合給藥時(shí),細(xì)胞毒性提高至SN38的14.56倍。采用Western blot評(píng)價(jià)Tf-L-SN38/P/siRNA對(duì)survivin基因的沉默作用。Tf與TAT-PEG-SN38可以增加脂質(zhì)體對(duì)survivin siRNA的遞送效率,與survivin siRNA脂質(zhì)體相比較,Tf-L-SN38/P/siRNA能顯著抑制HeLa細(xì)胞表達(dá)survivin蛋白。建立HeLa細(xì)胞裸鼠荷瘤模型評(píng)價(jià)Tf-L-SN38/P/siRNA體內(nèi)抗腫瘤效果。L-siRNA的抗腫瘤作用有限。Tf-L-SN38/P/siRNA具有最有效的抗腫瘤活性,與對(duì)照組相比腫瘤增長(zhǎng)抑制率為76.8%;與Tf-L-SN38相比,Tf-L-SN38/P/siRNA與siRNA共同給藥抑制了33.8%的腫瘤增長(zhǎng);與L-SN38/P/siRNA相比,Tf-L-SN38/P/siRNA在Tf靶向修飾后抑制了39.1%的腫瘤體積增長(zhǎng)。并且Tf-L-SN38/P/siRNA給藥后對(duì)肝臟、腎臟和小腸沒有明顯損傷。以L-SN38/P/siRNA作為對(duì)照,活體成像進(jìn)一步評(píng)估Tf-L-SN38/P/siRNA在體內(nèi)的靶向效率。Tf修飾后脂質(zhì)體在腫瘤部位具有更高的靶向性。綜上所述,本文建立了CPP修飾的自包封SN38前體藥物及其共遞送體系,并對(duì)其抗腫瘤活性進(jìn)行評(píng)價(jià),以期獲得抗腫瘤活性高、毒性低的SN38遞送體系。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R91
【圖文】：

完全恢復(fù)而 DNA 合成功能只有部分恢復(fù)[8有 TOP Ⅰ靶向性，當(dāng) TOP Ⅰ基因發(fā)生突變時(shí)。喜樹堿類化合物（CPTs）包括天然喜樹堿]，具有廣譜的抗腫瘤活性。CPTs 通過(guò)抑制 OP Ⅰ-DNA 形成中間復(fù)合體，抑制 DNA 的再 形成三元復(fù)合物，不與 TOP Ⅰ或 DNA 單獨(dú)導(dǎo)致 DNA 碎裂，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16, 17]。CP3,4-β）喹啉構(gòu)成的六元環(huán)骨架（環(huán) A，B）xy- -lactone（環(huán) E）。在 C20具有一個(gè)手性中理活性是其同分異構(gòu)體 20R-CPTs 的 10 ~ 1內(nèi)酯環(huán) E 和吡啶酮環(huán) D 對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制和 C10取代合成新的類似物，進(jìn)而提高 CP于其強(qiáng)大的抗腫瘤活性引起了科學(xué)家的廣泛

瘤化合物 CPT 的一種半合成產(chǎn)物 C10位和 C7位分別通過(guò)乙基和羥基8 的分子量為 392.4 g/mol，在 25 °C 為 2.65[22]。SN38 幾乎不溶于水（11劑中也難以溶解，SN38 僅在 0.5%解，因此限制了 SN38 的直接給藥表明 SN38 在開環(huán)形式可以提高溶 pH 可逆水解，水解機(jī)制如圖 1.3 所酯水解，當(dāng) pH 值為 7.4 時(shí)，SN38完全以內(nèi)酯形式存在；但當(dāng) pH > 9.，兩種形式的 SN38 處于等量的平活性，SN38 在生理?xiàng)l件下不穩(wěn)定，

SN38 的內(nèi)酯依賴 pH 可逆水解，水解機(jī)制如圖 1.3 所示。手型中心 C20位的羥基可以促進(jìn) SN38 內(nèi)酯水解，當(dāng) pH 值為 7.4 時(shí)，SN38 傾向于以羧酸鹽存在；當(dāng) pH 值≤ 4.5，SN38 完全以內(nèi)酯形式存在；但當(dāng) pH > 9.0 時(shí)，SN38 完全以羧酸鹽存在；在 pH = 6.7 時(shí)，兩種形式的 SN38 處于等量的平衡狀態(tài)[22, 24]。羧酸鹽形式的 SN38 不具有生理活性，SN38 在生理?xiàng)l件下不穩(wěn)定，這是 SN38 提供有效治療的一個(gè)主要障礙。圖 1.2 SN38 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 1.2 Chemical structure of SN38

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本文編號(hào)：2747582