【摘要】：Ⅱ型糖尿病是以胰島素敏感性降低、外周組織對(duì)葡萄糖的利用率降低以及胰島素抵抗為特征的代謝性疾病,占全球糖尿病的90%以上。Ⅱ型糖尿病的主要病征是高血糖,而長(zhǎng)期的高血糖癥狀會(huì)引發(fā)各種慢性并發(fā)癥,這是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要因素。在Ⅱ型糖尿病患者中,餐后血糖水平是血糖控制的重要指標(biāo)。為減少餐后高血糖,臨床上通常會(huì)使用一些合成的α-葡萄糖苷酶抑制劑(如阿卡波糖和伏格列波糖等)進(jìn)行治療,以減緩碳水化合物的消化和延緩葡萄糖的吸收。但臨床發(fā)現(xiàn)有些患者長(zhǎng)期使用合成的α-葡萄糖苷酶抑制劑會(huì)引起一些不良副作用,包括胃腸脹氣和腹部絞痛等。因此,開(kāi)發(fā)一些抑制α-葡萄糖苷酶活性的安全生物活性肽和蛋白質(zhì)至關(guān)重要。Aglycin是一種具有降血糖活性的新型生物活性肽,分子量只有3.7 kDa,由37個(gè)氨基酸殘基組成,其含有三對(duì)分子內(nèi)二硫鍵,目前僅可以從大豆或豌豆種子中進(jìn)行提取分離制備,步驟繁瑣,回收率低至1-5 mg/100 g干種子,同時(shí)比較難避免試劑殘留。因此,開(kāi)發(fā)一種高效生產(chǎn)高純度Aglycin的簡(jiǎn)單方法并研究其對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制的降糖活性,無(wú)疑具有重大的理論和現(xiàn)實(shí)意義。在本研究中,以活性肽Aglycin為研究目標(biāo),主要嘗試Aglycin在大腸桿菌原核表達(dá)體系中的高效表達(dá)方式,并以阿卡波糖為對(duì)照,檢測(cè)重組表達(dá)Aglycin的體外α-葡萄糖苷酶抑制活性。基于Trx標(biāo)簽的促溶功能,將Trx蛋白和Aglycin進(jìn)行連接,構(gòu)建融合表達(dá)載體并實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌的體內(nèi)表達(dá),最終成功獲得純度高達(dá)95%的Trx-Aglycin重組蛋白,并且蛋白濃度可達(dá)300μg/mL,產(chǎn)量約為25 mg/L菌液�；谧越M裝肽ELK16和18A能在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行自聚集的特性,將Aglycin通過(guò)一個(gè)內(nèi)含肽Mxe GyrA與自組裝肽連接,構(gòu)建能在體外自剪切的高效表達(dá)載體。首先,對(duì)含有自組裝肽(ELK16/18A)的兩種表達(dá)載體進(jìn)行蛋白表達(dá)條件和Mxe GyrA內(nèi)含肽切割效率的優(yōu)化,然后對(duì)這兩種載體所獲得的Aglycin的產(chǎn)率和純度進(jìn)行比較。結(jié)果表明,與用自組裝肽18A制備的Aglycin的產(chǎn)率(4.50 mg/g菌體濕重)和純度(~95.63%)相比,ELK16具有比18A更好的制備效果,具有更高的產(chǎn)率(5.53 mg/g菌體濕重)和純度(~98.15%)。通過(guò)自組裝肽(ELK16或18A)重組表達(dá)生產(chǎn)的Aglycin的產(chǎn)率比化學(xué)提取方法(1-5 mg/100 g干種子)提高了近100倍。因此,采用自組裝肽的基因工程手段重組表達(dá)Aglycin,工藝簡(jiǎn)單且產(chǎn)率高,優(yōu)于化學(xué)提取方法。最后,對(duì)重組表達(dá)得到的Trx-Aglycin蛋白和Aglycin多肽進(jìn)行了α-葡萄糖苷酶抑制的體外降糖活性檢測(cè)。經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)證明,Trx-Aglycin融合蛋白對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC_(50))大約為44.83μmol/L,而Aglycin多肽對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制的IC_(50)大約為36.48μmol/L,這比Trx-Aglycin融合蛋白降低了約20%,說(shuō)明Aglycin多肽比其帶Trx融合標(biāo)簽的蛋白對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性要強(qiáng)。另外,不管是Aglycin多肽還是Trx-Aglycin融合蛋白,均比阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制的IC_(50)(990μmol/L)低,說(shuō)明Aglycin比阿卡波糖有更強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性,這進(jìn)一步證明Aglycin有開(kāi)發(fā)為α-葡萄糖苷酶抑制劑的潛力。本研究主要提供了Aglycin在大腸桿菌中的兩種高效表達(dá)方式,首次通過(guò)基因工程的生物方法實(shí)現(xiàn)了Aglycin的重組表達(dá),并且驗(yàn)證其具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制的活性,這為Aglycin開(kāi)發(fā)為降糖多肽藥物奠定了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：Q78;R977.15
【圖文】：

于大鼠胰島素受體酪氨酸激酶活根中分離出一種分子量約為 4 -II 以及動(dòng)物胰島素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 B在其他豆科植物中被檢測(cè)到。物的生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要作用[6得到一種多肽——PA1b，它存在上述的大豆胰島素有較高的同對(duì) PA1b 的研究較多，它屬于 I[69]，它的三級(jí)結(jié)構(gòu)如圖 1-1。具對(duì)離子通道進(jìn)行阻斷、殺蟲(chóng)、抑構(gòu)家族中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的昆蟲(chóng)毒一的 Aglycin 多肽被發(fā)現(xiàn)對(duì)糖代

第一章 緒論α-葡萄糖苷酶與降血糖多肽的作用機(jī)理如圖 1-2，具有生物活性的多肽分子與苷酶的催化中心通過(guò)極性、氫鍵以及疏水性作用進(jìn)行結(jié)合，進(jìn)而影響多糖分解葡萄糖、果糖等）的過(guò)程[98]。研究表明，ASN32、ASP34 以及 THR83 是 α-葡的三個(gè)主要結(jié)合位點(diǎn)[99]。

圖 1-3Aglycin 的一級(jí)結(jié)構(gòu)圖[5]Fig. 1-3 The primary structure of Aglycincin 是從豬的腸道分離提取并鑒定出來(lái)制備出來(lái)的 Aglycin 含量極微，從 1 多肽，研究者猜測(cè)其來(lái)源于植物食物[大量的 Aglycin 多肽來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步的

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2743919