【摘要】：目的:設(shè)計(jì)、制備可干預(yù)黑色素合成的新型納米核酸制劑,并研究其對(duì)黑色素瘤A375細(xì)胞酪氨酸酶基因表達(dá)、細(xì)胞增殖及凋亡的影響。方法:1.設(shè)計(jì)針對(duì)酪氨酸酶(Tyrosinase,TYR)靶點(diǎn)的siRNA,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR篩選出抑制TYR mRNA效果最好的siRNA,用蛋白質(zhì)免疫印跡法進(jìn)一步分析TYR-siRNA對(duì)TYR蛋白表達(dá)的影響。2.通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TYR mRNA相對(duì)表達(dá)水平,通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率和細(xì)胞周期,比較不同濃度的TYR-siRNA、小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子MITF(Microphthalmia-associated transcription factors)-siRNA對(duì)TYR mRNA的相對(duì)表達(dá)水平及其對(duì)A375細(xì)胞凋亡、周期的影響。3.選出最佳靶點(diǎn)和最佳濃度的siRNA,制備納米核酸制劑。通過激光共聚焦顯微鏡觀察A375細(xì)胞對(duì)納米核酸制劑的攝取情況。4.運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)納米核酸制劑對(duì)A375細(xì)胞TYR mRNA的相對(duì)表達(dá)水平,運(yùn)用MTT法、DAPI染色法、流式細(xì)胞儀檢測(cè)法研究納米核酸制劑對(duì)A375細(xì)胞增殖、形態(tài)學(xué)變化和凋亡的影響。5.采用單因素方差分析對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果:1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR篩選出siRNA-2為干擾TYR mRNA效果最好的siRNA,同時(shí)蛋白質(zhì)免疫印跡法驗(yàn)證其在蛋白水平上同樣抑制TYR的表達(dá)(P0.05)。2.TYR mRNA表達(dá)量與TYR-siRNA濃度存在劑量依賴效應(yīng),隨siRNA濃度增大而降低(P0.05),細(xì)胞凋亡率與TYR-siRNA濃度存在劑量依賴效應(yīng),隨濃度增加而增大(P0.05)。3.TYR-siRNA阻滯細(xì)胞周期的S期,存在濃度依賴效應(yīng)(P0.05)。4.TYR mRNA表達(dá)量和MITF mRNA表達(dá)量與MITF-siRNA濃度存在劑量依賴效應(yīng),隨siRNA濃度增大而降低(P0.05),細(xì)胞凋亡率與MITF-siRNA濃度存在劑量依賴效應(yīng),隨濃度增加而增大(P0.05)。5.MITF-siRNA阻滯細(xì)胞周期的G0/G1期,存在濃度依賴效應(yīng)(P0.05)6.激光共聚焦顯微鏡觀察納米核酸制劑能被A375細(xì)胞攝取。7.納米核酸制劑干預(yù)A375細(xì)胞后,TYR mRNA相對(duì)表達(dá)量降低(P0.05),細(xì)胞增殖率降低(P0.05),激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核形態(tài)發(fā)生改變,能促進(jìn)細(xì)胞凋亡(P0.05)。結(jié)論:1.TYR-siRNA和MITF-siRNA均能有效抑制黑色素合成的關(guān)鍵酶TYR的mRNA表達(dá),并能誘導(dǎo)黑色素瘤A375細(xì)胞凋亡。2.TYR-siRNA和MITF-siRNA對(duì)細(xì)胞周期的影響不同,siRNA達(dá)到300 pmol時(shí),尤其是MITF-siRNA,細(xì)胞出現(xiàn)異常增殖,因此確定TYR為作用靶點(diǎn)。由于劑量依賴效應(yīng),選用200 pmol濃度制備納米核酸制劑。3.本研究制備的納米核酸制劑可以被黑色素瘤A375細(xì)胞攝取。4.納米核酸制劑能抑制TYR mRNA表達(dá),抑制細(xì)胞增殖,使細(xì)胞核形態(tài)皺縮、產(chǎn)生異染色質(zhì),從而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。5.纖維狀納米核酸制劑較球狀納米核酸制劑轉(zhuǎn)染siRNA的效率更高,更能有效抑制細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
【學(xué)位授予單位】：河北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R965
【圖文】：

A 轉(zhuǎn)染后 A375 細(xì)胞 TYR mRNA 的相對(duì)表達(dá)A2 抑制 A375 細(xì)胞 TYR 蛋白的表達(dá) siRNA2 對(duì)抑制 TYR 表達(dá)的能力，Western 蛋白表達(dá)水平。圖 2-2 結(jié)果顯示，siRNA2 轉(zhuǎn)

圖 2-2 TYR-siRNA2 轉(zhuǎn)染后 A375 細(xì)胞 TYR 蛋白的相對(duì)表達(dá)量（*P<0.05，2.4.3 TYR mRNA 表達(dá)量隨 TYR-siRNA2 濃度升高而降低分別將 100 pmol、200 pmol、300 pmol 的 TYR-siRNA2 轉(zhuǎn)染進(jìn)黑色素瘤 細(xì)胞后，利用熒光定量 PCR 檢測(cè)得到 A375 細(xì)胞 TYR mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

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1 王亞蘭;劉子君;李綺玲;耿憶薇;安靚;楊柳;;刺蒺藜及其配伍對(duì)人黑色素瘤A375細(xì)胞黑素代謝的影響[J];遼寧中醫(yī)雜志;2018年01期

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本文編號(hào)：2740858