發(fā)布時間：2020-07-03 15:11

【摘要】：聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly(ADP-ribose)polymerase,PARP)抑制劑是基于協(xié)同致死作用的新型小分子靶向藥物。目前已有4個PARP抑制劑先后獲批上市,在卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌等治療中取得巨大成功,在抗腫瘤領(lǐng)域占有重要地位。然而,PARP抑制劑的抗腫瘤機制尚未完全闡明,如PARP1-DNA捕獲理論(PARP1-DNA trapping)存在爭議;同時腫瘤對PARP抑制劑將不可避免地產(chǎn)生耐藥性,從而導(dǎo)致治療失敗,目前對其耐藥特性和機制仍缺乏全面了解。因此,本課題系統(tǒng)地研究了PARP抑制劑的抗腫瘤作用機制,闡明了決定PARP抑制劑藥效的關(guān)鍵因素,開發(fā)了更有效的高通量分子篩選模型。同時,對BRCA2缺陷胰腺癌Capan-1細胞的PARP抑制劑耐藥機制進行了研究,發(fā)現(xiàn)了BRCA2內(nèi)含子新突變和凋亡耐受的耐藥新機制,為PARP抑制劑的臨床開發(fā)與應(yīng)用、耐藥克服和預(yù)防提供了新的思路。在抗腫瘤機制研究方面,對決定PARP抑制劑藥效的關(guān)鍵因素進行了探索,闡明了細胞殺傷作用、PARP1-DNA捕獲強度、酶活抑制能力三者之間的關(guān)系。首先,發(fā)現(xiàn)了PARP抑制劑的PARP1-DNA捕獲強度與其細胞毒性的相關(guān)性不強。采取三種不同策略,包括不同PARP抑制劑同一濃度、同一PARP抑制劑不同濃度以及不同PARP抑制劑的IC_(50)條件下,進行PARP1-DNA捕獲與細胞毒性的相關(guān)性研究,均發(fā)現(xiàn)PARP抑制劑的細胞毒性不取決于PARP1-DNA捕獲強度。其次,發(fā)現(xiàn)PARP抑制劑細胞毒性依賴于細胞內(nèi)PARP酶活性。我們構(gòu)建了尤文氏瘤細胞的PARP1敲除株,然后穩(wěn)定回補野生型PARP1(WT)、酶活缺失型的點突變PARP1(E988K)、以及不同酶活強度的PARP1突變體。在親本細胞、PARP1敲除細胞以及12株P(guān)ARP1突變體細胞中,我們對細胞內(nèi)PARP酶活強度、PARP抑制劑對酶活抑制能力、PARP1-DNA捕獲強度與PARP抑制劑細胞毒性的關(guān)系進行了系統(tǒng)研究,發(fā)現(xiàn)PARP抑制劑的細胞毒性與不同細胞內(nèi)的PARP酶活相關(guān)性最強(r=-0.70;p=0.0052),與PARP1-DNA捕獲能力的相關(guān)性明顯弱于PARP酶活(r=-0.58;p=0.0284),而與酶活抑制能力的相關(guān)性最弱(r=-0.13;p=0.72)。此外,PARP1-DNA捕獲也與細胞內(nèi)PARP酶活高度相關(guān)(r=0.82;p=0.0003),與酶活抑制能力相關(guān)性較低(r=0.35;p=0.33)。經(jīng)典的基于組蛋白為底物的ELISA模型測得的不同PARP抑制劑抑制PARP1酶活能力與其細胞毒性缺乏相關(guān)性(r=0.3898;p=0.4245)。我們構(gòu)建了兩個熒光各向異性(FA)分子模型,并用DNA雙鏈損傷熒光各向異性模型(DSB-FA模型)測試了不同PARP抑制劑抑制PARP1-DNA解離的EC_(50),與17株敏感腫瘤細胞的IC_(50)的均值相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)除Niraparib之外,在其他5種PARP抑制劑中兩者具有極高的線性相關(guān)性(r=0.9984;p0.0001)。我們推測PARP抑制劑通過抑制PARP1的自身PAR化,使之不能從DNA上解離下來,從而增加PARP1-DNA結(jié)合能力,與其細胞水平的藥效相關(guān)性最強,強于PARP1-DNA捕獲。最后,我們對兩種FA模型以及現(xiàn)有PARP抑制劑分子評價模型進行比較分析,發(fā)現(xiàn)DSB-FA模型是一種新型、高效、快速、穩(wěn)定、低成本、無放射性污染并與細胞水平藥效相關(guān)性最高的PARP抑制劑分子篩選模型。在耐藥特性和機制研究方面,本研究通過濃度遞增誘導(dǎo)的方式分別構(gòu)建了Capan-1對PARP抑制劑Olaparib(OP)、Simmiparib(SP)和Talazoparib(TP)的耐藥細胞,分別命名為Capan-1/OP、Capan-1/SP和Capan-1/TP。細胞生物學(xué)結(jié)果顯示耐藥細胞株在細胞形態(tài)、增殖速度、遷移能力上沒有明顯或者一致性變化,其惡性程度也沒有明顯增加。三個耐藥細胞株不僅對誘導(dǎo)PARP抑制劑具有不同程度的耐藥,而且對其他PARP抑制劑也產(chǎn)生了交叉耐藥。我們對耐藥機制進行了深入研究,發(fā)現(xiàn)耐藥細胞中PARP家族成員、多藥耐藥蛋白P-gp等沒有發(fā)生明顯變化;耐藥細胞的BRCA2缺失突變位點c.6174delT也沒有出現(xiàn)回復(fù)突變或者缺失。全基因測序顯示,BRCA2的11號內(nèi)含子出現(xiàn)新的雜合子突變,這一突變導(dǎo)致了新的具有C末端的BRCA2剪切體形成;然而新C-BRCA2蛋白剪切體僅貢獻部分的PARP抑制劑耐藥(32.22~49.03%)。我們發(fā)現(xiàn)耐藥細胞中存在較高的DNA損傷蓄積,且不影響細胞的存活和衰老,提示耐藥細胞對DNA損傷蓄積具有一定的耐受。在耐藥細胞和親本細胞中,等效濃度的PARP抑制劑能引起同等程度甚至更高程度的DNA損傷蓄積和細胞周期阻滯,但耐藥細胞中的凋亡信號(包括磷脂酰絲氨酸外翻、Caspase3/7/8/9激活和線粒體膜電位下調(diào))顯著低于親本細胞。進一步研究發(fā)現(xiàn),耐藥細胞中抗凋亡蛋白COX-2和BIRC3的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平顯著高于親本細胞。干擾COX-2或BIRC3后,耐藥細胞對PARP抑制劑的敏感性最高可恢復(fù)72.33%和70.31%,同時部分恢復(fù)了PARP抑制劑引起的耐藥細胞凋亡信號,提示COX-2和BIRC3高表達是PARP抑制劑耐藥機制之一。BIRC3抑制劑LCL161與PARP抑制劑聯(lián)用,能顯著恢復(fù)耐藥細胞對PARP抑制劑的敏感性,為耐藥腫瘤的治療提供了新線索。最后,我們發(fā)現(xiàn)PARP抑制劑、PARP1敲除均可以引起COX-2和BIRC3轉(zhuǎn)錄水平的顯著上調(diào),說明PARP1是COX-2和BIRC3的新型轉(zhuǎn)錄負調(diào)控因子。綜上所述,本研究闡明了PARP抑制劑抗腫瘤藥效的關(guān)鍵影響因素是細胞內(nèi)PARP酶活性;證明了PARP抑制劑抑制DNA上聚合態(tài)PAR的形成,從而促進PARP1-DNA結(jié)合,與PARP抑制劑的細胞毒性相關(guān)性強于PARP1-DNA捕獲,并基于此建立了新型高效預(yù)測PARP抑制劑細胞毒性的分子水平篩選評價體系。耐藥機制研究方面,通過構(gòu)建了三種不同PARP抑制劑的胰腺癌Capan-1耐藥細胞株,闡明了BRCA2內(nèi)含子11的新突變和COX-2/BIRC3過表達介導(dǎo)的凋亡耐受貢獻于PARP抑制劑耐藥。以上研究為PARP抑制劑抗腫瘤和耐藥機制研究增添了新的內(nèi)容,對于促進PARP抑制劑的臨床開發(fā)與應(yīng)用、耐藥性克服具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院上海藥物研究所)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R96
【圖文】：

在 DNA 損傷位點形成空間位阻以及大量的負離子積聚，一方面可NA 損傷位點周圍的 DNA 分子與 DNA 損傷位點發(fā)生錯配重組，另一方阻止 PARP1 與 DNA 損傷位點的進一步結(jié)合并最終導(dǎo)致 PARP1/2 從 D下來，從而為 DNA 修復(fù)相關(guān)蛋白發(fā)揮作用提供空間。解離下來的 PARP物在聚腺苷二磷酸核糖水解酶（PARG）作用下被裂解，裂解后的 ADP新用于合成 NAD+，而重新形成單體的 PARP1/2 可被再次激活，如此循 DNA 損傷位點，完成 DNA 損傷修復(fù)[2, 8-10]。PARP2 與 PARP1 具有 6源性，其一般通過聚合態(tài) PAR 招募并激活催化分支的 PAR 鏈合成參與修復(fù)[11, 12]。除了 PARP1/2 在 DNA 損傷修復(fù)應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用外，的其它成員在 DNA 損傷修復(fù)、炎癥調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因、細胞周期調(diào)控以及有絲分裂等一系列廣泛的細胞代謝進程中發(fā)揮著重 13, 14]。

圖 1.2 PARP 抑制劑抗腫瘤機制1.1.2.3 PARP 抑制劑增加 PARP1-DNA 捕獲然而，臨床前以及臨床研究的多個證據(jù)表明，PARP 抑制劑的酶活性抑制能力與其抗腫瘤細胞毒性和臨床療效相關(guān)性低[25, 27-29]，因此，對 PARP 抑制劑基于酶活抑制發(fā)揮其抗腫瘤作用的機制提出了挑戰(zhàn)。為此，Thomas Helleday 等提出了 PARP 捕獲理論[15, 30, 31]，認為 PARP 抑制劑并不影響 PARP 酶與 DNA 損傷位點的結(jié)合，PARP 抑制劑抑制 PAR 聚合物形成造成 PARP 酶不能順利脫離 DNA，其結(jié)果是 PARP 抑制劑不僅抑制了 PARP 酶的催化作用，而且失活的 PARP 蛋白形成空間位阻，阻礙 DNA 修復(fù)相關(guān)蛋白發(fā)揮作用或者影響發(fā)生在 DNA 上的其它事件，例如復(fù)制（圖 1.2 B）。由此，使 DNA 單鏈修復(fù)失效，DNA 損傷蓄積，殺傷細胞[15, 30, 31]。然而上述理論難以解釋 PARP 抑制劑的酶活抑制能力與其抗腫瘤作用相關(guān)性低的原因。隨后，Pommier 等進一步發(fā)展出亞細胞蛋白組分分離方

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