【摘要】：隨著物質(zhì)生活水平的提高,人們?cè)陲嬍撤矫姘l(fā)生了改變,與飲食相關(guān)疾病的發(fā)病率持續(xù)上升。糖尿病是其中最為常見、發(fā)病率最高的流行性疾病之一。糖尿病有眾多并發(fā)癥,糖尿病血管并發(fā)癥則是導(dǎo)致糖尿病病人發(fā)病和死亡的首要原因。體內(nèi)血糖水平持續(xù)升高的情況下,會(huì)造成晚期糖基化終末產(chǎn)物(Advanced glycation end products,AGEs)生成速度加快,其會(huì)沉積在血管壁上,難以消除。研究證實(shí),AGEs與RAGE(the Receptor of Advanced Glycation End products)結(jié)合后,激活氧化應(yīng)激并誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧(ROS),導(dǎo)致細(xì)胞因子分泌異常,并激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路,最終導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變和功能的紊亂。因此,降低或抑制AGEs的生成可能會(huì)有效延緩和預(yù)防糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。目前,許多化學(xué)藥物已被用于預(yù)防糖尿病并發(fā)癥以及與AGEs相關(guān)疾病的治療。但長(zhǎng)期使用可能會(huì)出現(xiàn)如胃腸道不適及肝中毒等副作用,因此,天然抗氧化劑成為防治AGEs形成以及治療糖尿病并發(fā)癥的最有前景的藥物之一。實(shí)驗(yàn)室前期已發(fā)現(xiàn)APRF和雪菊花色苷均具有抗氧化活性,本研究將進(jìn)一步考察這兩種花色苷體外抑制AGEs生成能力;以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)為實(shí)驗(yàn)材料,研究?jī)煞N花色苷對(duì)AGEs損傷HUVEC細(xì)胞的保護(hù)作用及相關(guān)作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外制備AGEs,采用紫外分光光度法、熒光分光度法和SDS-PAGE等鑒定AGEs的生成;并采用熒光分光光度法、圓二色譜及SDS-PAGE等方法檢測(cè) APRF(APRF)(0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL)和雪菊花色苷(ACTN)(0.075 mg/mL、0.15 mg/mL、0.3 mg/mL)體外抑制 AGEs 作用;鏡下觀察 APRF(0.2 mg/mL、0.4 mg/mL)和 ACTN(0.5 mg/mL、1.0 mg/mL)預(yù)處理1 h再加入AGEs(200 μg/mL)作用24 h后對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響;通過(guò)DCFH-DA染色檢測(cè)AGEs(200 μg/mL)處理24 h胞內(nèi)活性氧(ROS)生成水平;及兩種花色苷預(yù)處理1 h后再加入AGEs(200 μg/mL)作用24 h后胞內(nèi)ROS水平的變化;Real-Time PCR 檢測(cè) AGEs(200 μg/mL)損傷組、AGEs+ APRF(0.2 mg/mL、0.4 mg/mL)干預(yù)組以及 AGEs+ACTN(0.5 mg/mL、1.0 mg/mL)干預(yù)組的細(xì)胞粘附分子(ICAM-1、VCAM-1)、炎癥因子(ICAM-1、VCAM-1、IL-1β、IL-18、CRP、NLRP3、Caspase-1)、和 DNA 修復(fù)酶(MTH1、PARP-1)等相關(guān)mRNA的轉(zhuǎn)錄水平;Western blot方法分別檢測(cè)AGEs(200 μg/mL)損傷組、AGEs+APRF(0.2mg/mL、0.4mg/mL)干預(yù)組、AGEs+ACTN(0.5mg/mL、1.0 mg/mL)干預(yù)組細(xì)胞的NF-κBp65磷酸化蛋白和總蛋白p38MAPK表達(dá)、P-IκB磷酸化蛋白、IκB蛋白、Nrf2總蛋白和核蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明:BSA與葡萄糖在37 ℃、無(wú)菌條件下培養(yǎng)6周后生成AGEs;熒光光譜、圓二色譜及SDS-PAGE方法結(jié)果顯示,與AGEs組相比,兩種花色苷均可以體外抑制AGEs的生成;鏡下結(jié)果表明APRF(0.2mg/mL、0.4mg/mL)和雪菊花色苷(0.5 mg/mL、1.0 mg/mL)預(yù)處理后,可顯著抑制AGEs損傷HUVECs細(xì)胞;DCFH-DA染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明花色苷干預(yù)受損的HUVECs細(xì)胞后,均能夠顯著降低細(xì)胞ROS生成水平;Real-Time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,AGEs損傷組細(xì)胞內(nèi)相關(guān)因子表達(dá)量顯著上調(diào)。AGEs+花色苷干預(yù)組以濃度-劑量(?)estern blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與空白對(duì)照組相比,白對(duì)照組相比,各組間細(xì)胞p38 MAPK磷酸化蛋白和NF-κB p65磷酸化蛋白、P-IκB磷酸化蛋白以及核蛋白Nrf2表達(dá)顯著性升高(p0.05),Nrf2、NF-κB p65、p38 MAPK和IκκB蛋白表達(dá)未出現(xiàn)變化。說(shuō)明兩種花色苷可以通過(guò)抑制AGEs激活血管內(nèi)皮細(xì)胞Nrf2、p38MAPK、NF-κBp65以及P-IκB信號(hào)通路而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。以上結(jié)果表明兩種花色苷均可以體外抑制AGEs的生成并通過(guò)抑制氧化應(yīng)激、降低細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)、阻斷細(xì)胞相應(yīng)的信號(hào)通路,從而抑制AGEs誘導(dǎo)的HUVECs損傷。本實(shí)驗(yàn)為APRF和ACTN應(yīng)用到抗糖化及糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化藥物研究提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：遼寧大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R91
【圖文】：

（邋／；＜０．０５勾ＡＧＥｓ組相比差異顯著）逡逑１．５．邐３．邋２邋ＢＳＡ／Ｇｌｕｃｏｓｅ反應(yīng)體系中ＡＣＴＮ對(duì)ＡＧＥｓ的抑制作用逡逑圖４邋（Ａ）為ＢＳＡ／Ｇｌｕｃｏｓｅ反應(yīng)體系中ＡＣＴＮ對(duì)ＡＧＥｓ生成抑制作用的熒光逡逑強(qiáng)度光譜。圖４邋（Ｂ）為ＡＣＴＮ對(duì)ＡＧＥｓ生成抑制率結(jié)果。與未發(fā)生糖基化反應(yīng)逡逑的ＢＳＡ相比，ＡＧＥ－ＢＳＡ的特征性熒光增加約４．５倍。當(dāng)ＡＣＴＮ被添加到由葡逡逑萄糖介導(dǎo)的ＢＳＡ反應(yīng)體系屮時(shí)，其熒光強(qiáng)度以濃度－劑量依賴性方式降低。逡逑結(jié)果表明，隨ＢＳＡ／Ｇｌｕｃｏｓｅ反應(yīng)體系中添加ＡＣＴＮ濃度的增加，ＡＣＴＮ對(duì)逡逑１８逡逑

而同時(shí)添加ＡＰＲＦ后，蛋白質(zhì)的：級(jí)結(jié)構(gòu)的ａ－螺旋含量從４０．１２％分逡逑別上升到邋４２．１４％邋（０．１２５邋ｍｇ／ｍＬ）、４４．１８％邋（０．２５邋ｍｇ／ｍＬ）。這表明邋ＡＰＲＦ邋能夠穩(wěn)逡逑定ＢＳＡ的結(jié)構(gòu)并阻止ＢＳＡ發(fā)生糖基化（圖５）。此外，結(jié)果也表明ＡＰＲＦ抑諱ＩＪ逡逑ＢＳＡ結(jié)構(gòu)的損失具有濃度－劑量依賴性。逡逑１９逡逑

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本文編號(hào)：2732925