【摘要】：熱原是一類在宿主體內(nèi)可以引起發(fā)熱和誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的異構(gòu)類化合物。在臨床上,熱原是指能使哺乳動物產(chǎn)生熱原反應(yīng)的物質(zhì)。熱原按照來源分為外源性熱原和內(nèi)源性熱原。外源性熱原主要來源于機體外,分別為微生物(如細(xì)菌、病毒、真菌)與非微生物(如抗原、抗腫瘤藥)性熱原,內(nèi)源性熱原主要包括機體內(nèi)的激素(如類固醇、前列腺素)與細(xì)胞因子(如腫瘤壞死因子、干擾素、生長因子、白介素)。使用熱原污染的藥品和醫(yī)療器械會引起系統(tǒng)性炎癥,在最糟糕的情況下,則會引起敗血性休克。因此,準(zhǔn)確和快速量化熱原對藥品安全是至關(guān)重要的。到目前為止,家兔法、鱟試劑法和單核細(xì)胞激活試驗檢測法對于熱原的檢測都存在限制。在我們的研究中,我們致力于開發(fā)一種利用熒光素酶報告系統(tǒng)來靈敏、可靠、快速地檢測熱原的方法。先前的報道已經(jīng)表明,細(xì)菌鞭毛蛋白可以通過Toll樣受體TLR5刺激人肺泡上皮細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-8。然而,其他的熱原物質(zhì)是如何誘導(dǎo)激活肺上皮細(xì)胞還沒有完全被闡釋清楚。脂多糖(LPS,也被稱為內(nèi)毒素)作為最主要的熱原,是細(xì)胞因子最有效的細(xì)菌誘導(dǎo)劑之一。在感染過程中,熱原刺激人的單核細(xì)胞去合成或者釋放炎癥細(xì)胞因子,包括白介-1β,白介-6,腫瘤壞死因子-α。而NF-κB是調(diào)控編碼這些促炎因子基因的主要轉(zhuǎn)錄因子。與此同時,人類β-干擾素(IFN-β)通過增強TNF依賴的TNF的產(chǎn)生,顯著性增加了正常家兔對內(nèi)毒素的發(fā)熱反應(yīng),而且也恢復(fù)了致敏原耐受的家兔對內(nèi)毒素的正常發(fā)熱反應(yīng)。鑒于此,我們把含有NF-κB應(yīng)答元件或者IFN-β啟動子的熒光素酶基因插入到慢病毒載體中,然后穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中,再經(jīng)過流式分選單克隆,最后利用熒光素酶報告系統(tǒng)來鑒定單克隆細(xì)胞的活性,從而構(gòu)建出穩(wěn)定的人A549熒光素酶報告細(xì)胞系。我們的結(jié)果表明幾株NF-κB單克隆穩(wěn)定細(xì)胞對0.1EU/mL的內(nèi)毒素響應(yīng),而這是少于人的發(fā)熱閾值0.3EU/mL內(nèi)毒素的。我們進一步使用靈敏度為0.125 EU/mL的鱟試劑與報告細(xì)胞比較,這是藥物中廣泛使用的鱟試劑靈敏度,以評估相同條件下的熱原,結(jié)果顯示報告細(xì)胞達(dá)到了鱟試劑檢測法同等的靈敏度。此外,我們進一步研究報告細(xì)胞發(fā)現(xiàn),和原始的A549相比,報告細(xì)胞克隆在低濃度內(nèi)毒素刺激下就能被激活并上調(diào)TLR4的表達(dá)。這些結(jié)果表明以人肺泡上皮細(xì)胞為基礎(chǔ)的報告實驗對于進一步開發(fā)可替代的熱原檢測方法很有潛力同時也是可行的。因此,穩(wěn)定的熒光素酶報告細(xì)胞很有可能進一步發(fā)展成為一種既快速又靈敏的熱原評估方法。
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R927.12

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本文編號：2714944