【摘要】：右美托咪啶(dexmedetomidine,DMED)是作用于α_2-AR的高效、高選擇性激動(dòng)劑,因其具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、神經(jīng)保護(hù)及抗傷害效應(yīng)而廣泛用于獸醫(yī)學(xué)麻醉及臨床麻醉,但臨床上尚缺乏有效對(duì)抗DMED鎮(zhèn)靜效應(yīng)的拮抗劑。α_2-AR受體激活后與百日咳毒素敏感的G_(i/o)型G蛋白偶聯(lián),使其解離為G_(αi/o)亞基和G_(βγ)亞基,其中G_(βγ)亞基除與G_α亞基結(jié)合外,還參與多種GPCR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)作用。目前有關(guān)G_(βγ)亞基及其下游信號(hào)分子如何影響G_(αi/o)亞基及其信號(hào)通路的報(bào)道較少,其對(duì)DMED鎮(zhèn)靜效應(yīng)的影響也不清楚。本課題首先評(píng)價(jià)了α_2-AR激動(dòng)劑DMED的鎮(zhèn)靜效應(yīng)以及α_2-AR高選擇性拮抗劑阿替美唑(atipamezole,ATI)對(duì)該效應(yīng)的拮抗作用;其次研究了α_2-AR受體后信號(hào)通路影響DMED鎮(zhèn)靜作用的機(jī)制,明確G_(αi/o)-AC-cAMP通路在DMED誘導(dǎo)鎮(zhèn)靜中的重要作用,揭示G_(βγ)及其下游信號(hào)分子通過(guò)影響AC-cAMP通路和下游蛋白pERK、pCREB磷酸化參與調(diào)控DMED的鎮(zhèn)靜效應(yīng)。研究目的本課題旨在研究DMED的鎮(zhèn)靜效應(yīng)并對(duì)其拮抗劑ATI的藥效學(xué)進(jìn)行評(píng)價(jià);明確DMED激活α_(2A)-AR產(chǎn)生鎮(zhèn)靜效應(yīng)的受體后機(jī)制;揭示G_(αi/o)、G_(βγ)亞基及其下游信號(hào)分子參與調(diào)控DMED鎮(zhèn)靜效應(yīng)的可能機(jī)制。研究?jī)?nèi)容與方法1、DMED鎮(zhèn)靜效應(yīng)及ATI拮抗作用評(píng)價(jià):采用大小鼠翻正反射行為模型、抓力模型、體溫測(cè)量、血壓測(cè)量等評(píng)價(jià)DMED誘導(dǎo)鎮(zhèn)靜的量效關(guān)系及ATI的拮抗作用。2、G蛋白G_(αi/o)、G_(βγ)亞基及其下游信號(hào)分子對(duì)DMED鎮(zhèn)靜效應(yīng)的影響:觀察側(cè)腦室注射G_(αi/o)/G_(βγ)亞基及下游信號(hào)分子激活劑或抑制劑對(duì)DMED誘導(dǎo)小鼠翻正反射行為消失的影響。3、G_(αi/o)、G_(βγ)亞基及其下游信號(hào)分子對(duì)DMED鎮(zhèn)靜作用影響的可能機(jī)制:構(gòu)建CHO-α_(2A)-AR穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞,通過(guò)分析胞內(nèi)α_(2A)-AR mRNA和蛋白表達(dá)情況篩選細(xì)胞株;通過(guò)檢測(cè)DMED作用后胞內(nèi)cAMP含量變化驗(yàn)證受體功能。在此基礎(chǔ)上,觀察DMED和G_(βγ)亞基下游信號(hào)分子激活劑或抑制合并給藥對(duì)Forskolin(FSK)激活A(yù)C后增強(qiáng)cAMP含量的影響,以及對(duì)胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca~(2+)]i)的影響。另外,采用Western-Blot法檢測(cè)胞內(nèi)pERK、pCREB的變化。研究結(jié)果1、α_2-AR激動(dòng)劑鎮(zhèn)靜與毒性效應(yīng)評(píng)價(jià)DMED(0.10~0.32 mg·kg~(-1))可劑量依賴性誘導(dǎo)小鼠翻正反射行為消失,不同給藥方式的ED_(50)分別為0.15 mg·kg~(-1)(i.v.)和0.18 mg·kg~(-1)(s.c.)。鎮(zhèn)靜劑量下,DMED劑量依賴性延長(zhǎng)制動(dòng)時(shí)間,誘導(dǎo)時(shí)間無(wú)顯著差異;另外,美托咪啶(medetomidine,MED)鎮(zhèn)靜效應(yīng)與DMED相似,不同給藥方式的ED_(50)分別為0.28 mg·kg~(-1)(i.v.)和0.34 mg·kg~(-1)(s.c.),其效應(yīng)約為DMED的0.5倍。在大鼠翻正反射行為模型中,DMED和MED產(chǎn)生鎮(zhèn)靜效應(yīng)的ED_(50)分別為11.71μg·kg~(-1)(i.v.)和26.58μg·kg~(-1)(i.v.)。在小鼠急性毒性模型中,DMED的LD_(50)為26.73mg·kg~(-1)(i.v.),安全指數(shù)(LD_1/ED_(99))為14,提示DMED的安全窗口較大。2、ATI對(duì)DMED誘導(dǎo)鎮(zhèn)靜的拮抗作用及毒性效應(yīng)評(píng)價(jià)根據(jù)DMED誘導(dǎo)鎮(zhèn)靜的量效關(guān)系曲線,選擇0.20 mg·kg~(-1)(ED_(99))和0.80mg·kg~(-1)(4倍ED_(99))作為后續(xù)誘導(dǎo)大、小鼠翻正反射行為消失的造模劑量。在小鼠模型中,ATI(0.005~0.05 mg·kg~(-1))劑量依賴性拮抗0.20 mg·kg~-11 DMED的鎮(zhèn)靜效應(yīng),ED_(50)為12.44μg·kg~(-1);ATI(0.05-0.4 mg·kg~(-1))劑量依賴性拮抗0.80mg·kg~(-1)DMED產(chǎn)生的鎮(zhèn)靜效應(yīng),ED_(50)為0.17 mg·kg~(-1)。在大鼠模型中,ATI對(duì)抗0.20 mg·kg~-11 DMED鎮(zhèn)靜效應(yīng)的ED_(50)為0.06 mg·kg~(-1);0.05 mg·kg~(-1) ATI即可產(chǎn)生顯著的催醒作用,0.15 mg·kg~(-1) ATI的催醒率為100%。另外,ATI還可劑量依賴性地拮抗DMED致小鼠低體溫和肌松作用,逆轉(zhuǎn)DMED致大鼠血壓下降作用。在大、小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)中,ATI的LD_(50)分別為47.57 mg·kg~(-1)(i.m.)和49.47mg·kg~(-1)(i.m.),提示ATI的安全窗口較大。3、DMED誘導(dǎo)鎮(zhèn)靜效應(yīng)的分子機(jī)制(1)G_(αi/o)-AC-cAMP-PKA通路分子對(duì)DMED鎮(zhèn)靜效應(yīng)的影響DMED(100~900 nmol/kg,i.v.)劑量依賴性升高小鼠翻正反射消失率,ED_(50)為193.70 nmol/kg。cAMP類似物dbcAMP(50 nmol/5μl/只,i.c.v.)和PDE4抑制劑rolipram(100 nmol/5μl/只,i.c.v.)提前15 min給藥,顯著降低DMED致小鼠翻正反射消失率,使量效曲線右移,ED_(50)分別升至375.0和433.3 nmol/kg。PKA抑制劑H89(20 nmol/5μl/只,i.c.v.)提前15 min給藥,可增強(qiáng)DMED鎮(zhèn)靜效應(yīng),使其量效曲線左移,ED_(50)降至163 nmol/kg。dbcAMP、rolipram和H89單獨(dú)給藥對(duì)小鼠翻正反射行為無(wú)影響。(2)G_(βγ)亞基及下游信號(hào)分子對(duì)DMED鎮(zhèn)靜效應(yīng)的影響G_(βγ)亞基抑制劑gallein(100 mg/kg,i.v.)和M119(100 mg/kg,i.v.)提前15 min給藥,可增強(qiáng)DMED鎮(zhèn)靜效應(yīng),使其量效曲線左移,ED_(50)分別降低到136.5和113.6 nmol/kg。PLC抑制劑U73122(10 nmol/5μl/只,i.c.v)和PKC抑制劑GF109203X(242 pmol/5μl/只,i.c.v)提前15 min給藥,可增強(qiáng)DMED鎮(zhèn)靜效應(yīng),使其量效曲線左移,ED_(50)分別降至42.5、110.1和85.2 nmol/kg。GRK抑制劑β-ARK1inhibitor(10 nmol/5μl/只,i.c.v.)和MEK抑制劑PD98059(10 nmol/5μl/只,i.c.v)對(duì)DMED鎮(zhèn)靜效應(yīng)無(wú)明顯影響。(3)G_(βγ)亞基介導(dǎo)DMED鎮(zhèn)靜效應(yīng)機(jī)制(1)CHO-α_(2A)-AR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株構(gòu)建puro-pCDH-α_(2A)-AR重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后,經(jīng)G418(200 mg/kg)壓力篩選獲得6株呈α_(2A)-AR陽(yáng)性表達(dá)的CHO-α_(2A)-AR細(xì)胞。通過(guò)檢測(cè)DMED合用FSK處理后胞內(nèi)cAMP含量變化,篩得3號(hào)細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(2)G_(βγ)下游信號(hào)分子抑制劑對(duì)胞內(nèi)cAMP含量的影響5μMβARK1抑制劑、G_(βγ)亞基抑制劑gallein、PKC抑制劑GF109203X持續(xù)處理CHO-α_(2A)-AR細(xì)胞1小時(shí)后抑制FSK(10μM)引起的胞內(nèi)cAMP含量升高;G_(βγ)亞基抑制劑M119、PLC抑制劑U73122、MEK抑制劑PD98059對(duì)FSK引起的cAMP含量升高無(wú)影響。上述化合物對(duì)DMED抑制FSK升高胞內(nèi)cAMP含量的效應(yīng)無(wú)顯著影響。(3)G_(βγ)下游信號(hào)分子抑制劑對(duì)[Ca~(2+)]i的影響DMED(5μM)、G_(βγ)亞基抑制劑gallein和M119(5μM)對(duì)胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca~(2+)]i)無(wú)顯著影響;DMED(5μM)與G_(βγ)亞基抑制劑gallein或M119(5μM)合用時(shí)可顯著增強(qiáng)胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca~(2+)]i)。(4)G_(βγ)下游信號(hào)分子抑制劑對(duì)pERK表達(dá)的影響DMED(5μM)隨時(shí)間延長(zhǎng)顯著上調(diào)胞內(nèi)pERK的表達(dá),1 min開始升高,5 min達(dá)到峰值,60 min與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異。G_(βγ)亞基抑制劑gallein(5μM)持續(xù)作用5-30 min顯著增強(qiáng)pERK表達(dá),且顯著增強(qiáng)DMED(5μM)引起的pERK上調(diào),延長(zhǎng)上調(diào)時(shí)間。G_(βγ)亞基抑制劑M119產(chǎn)生與gallein相似的作用。PKC抑制劑GF109203X(5μM);βARK1抑制劑(5μM)對(duì)pERK表達(dá)無(wú)影響,但顯著增強(qiáng)DMED(5μM)引起的pERK上調(diào)。(5)G_(βγ)下游信號(hào)分子抑制劑對(duì)pCREB表達(dá)的影響DMED(5μM)可顯著增強(qiáng)胞內(nèi)pCREB表達(dá),5 min開始升高,15 min達(dá)到峰值,60 min與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異。G_(βγ)亞基抑制劑gallein(5μM)、M119(5μM)可顯著增強(qiáng)pCREB表達(dá),并增強(qiáng)DMED引起的pCREB上調(diào);βARK1抑制劑、PKC抑制劑GF109203X、MEK抑制劑PD98059(5μM)對(duì)pCREB表達(dá)無(wú)影響,但能夠增強(qiáng)DMED(5μM)引起的pCREB上調(diào)。(4)G_(αi/o)-cAMP-PKA通路影響DMED鎮(zhèn)靜效應(yīng)的機(jī)制dbcAMP和rolipram(5μM)對(duì)胞內(nèi)pERK、pCREB表達(dá)無(wú)影響,但都能顯著抑制DMED(5μM)引起的pERK上調(diào),不影響DMED(5μM)引起的pCREB上調(diào)。1、ATI可有效拮抗DMED的強(qiáng)鎮(zhèn)靜效應(yīng)及其所致低體溫、肌松、低自發(fā)活動(dòng)和低血壓等副作用,安全性較高,可開發(fā)為臨床α_2-AR拮抗劑。2、DMED激活α_(2A)-AR后,通過(guò)抑制G_(αi/o)-AC-cAMP通路,降低胞內(nèi)cAMP含量引起鎮(zhèn)靜效應(yīng);同時(shí)通過(guò)增強(qiáng)G_(βγ)亞基相關(guān)信號(hào)通路直接或間接影響胞內(nèi)cAMP含量、[Ca~(2+)]i、ERK和CREB磷酸化程度,調(diào)節(jié)鎮(zhèn)靜效應(yīng)。3、pERK正向調(diào)節(jié)DMED鎮(zhèn)靜效應(yīng);pCREB可以作為DMED及相關(guān)分子發(fā)揮鎮(zhèn)靜效應(yīng)的下游標(biāo)志蛋白。
【圖文】：

2A dbcAMP 對(duì) DMED 介導(dǎo)鎮(zhèn)靜效應(yīng)的低 DMED 致小鼠翻正反射消失，**P<0.01，*P<OVA 及 Tukey’s test，n=10.dbcAMP 對(duì) DMED 介導(dǎo)鎮(zhèn)靜效應(yīng)的誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng) DMED（400，600 nmol/kg）引起的小鼠翻 DMED 組相比較；Mean±SEM，Two-way AN

bcAMP 對(duì) DMED 介導(dǎo)鎮(zhèn)靜效應(yīng)的誘導(dǎo)長(zhǎng) DMED（400，600 nmol/kg）引起的小鼠翻DMED 組相比較；Mean±SEM，，Two-way ANP 對(duì) DMED 引起的小鼠翻正反射消失制動(dòng)起的小鼠翻正反射消失制動(dòng)持續(xù)時(shí)間無(wú)顯著影NOVA 及 Tukey’s test， n=10.
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R965

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本文編號(hào)：2696082