【摘要】：有機陰離子轉運多肽(Organic anion transporting polepeptides,OATPs)屬于溶質轉運體(Solute carrier,SLC)超家族,是一類重要的藥物攝取轉運體。按照氨基酸序列的同源性它們被分為6個亞家族。OATPs是一類多特異性的轉運體,它們介導非鈉離子依賴的廣泛的兩親有機溶質的轉運,包括膽汁鹽、類花生酸、有機染料、甾體激素綴合物、甲狀腺激許多藥物和其他外源性物質。其中OATP1B1與OATP1B3是該類轉運蛋白的重要成員,它們主要分布在人肝細胞膜的基底外側膜上,在肝細胞的藥物清除中發(fā)揮重要作用。OATP1B1與OATP1B3包含12個跨膜區(qū),且兩者的同源性高達80%,因此兩者在結構與功能方面具有很大的相似性。其中雌酮-3-硫酸酯(Estrone-3-sulfate,E3S)是OATP1B1與OATP1B3共同的底物。然而當兒茶素類化合物表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)與 E3S 同時給藥時,EGCG 能激動 OATP1B3對E3S的攝取,但是卻抑制OATP1B1對E3S的攝取。有文獻報道OATP1B3可被其他小分子激動,但對小分子激動OATP1B3的分子機制研究目前并沒有文獻報道。因此本論文的主要研究目標即是確定OATP1B3中哪些結構域和氨基酸殘基對小分子的激動起重要作用,為此我們構建了 OATP1B3的12個嵌合蛋白,即OATP1B3的12個跨膜區(qū)域分別用OATP1B1對應的部分進行替換。功能研究結果表明,當OATP1B3的TM1和TM10被OATP1B1對應的部分替換時,小分子調節(jié)劑EGCG對OATP1B3的激動作用顯著降低,甚至呈現(xiàn)抑制的趨勢。以上結果表明,TM1與TM10這兩個跨膜區(qū)是對小分子的激動起重要作用的結構域。將OATP1B1與OATP1B3在TM1的氨基酸序列進行比對發(fā)現(xiàn),兩者在TM1有五個氨基酸不同。為了進一步確定哪幾個氨基酸是起主要作用的,我們將OATP1B3中的五個氨基酸殘基分別突變?yōu)镺ATP1B1中對應的氨基酸殘基,得到OATP1B3-F27L、F36L、Y38F、A42T和G45A五個單突變蛋白。功能研究表明,當OATP1B3在45位的氨基酸由柔性最大的甘氨酸突變成丙氨酸時,小分子調節(jié)劑EGCG對OATP1B3的激動作用顯著降低。類似地,OATP1B3在TM10有14個氨基酸與OATP1B1不同,通過定點突變,我們得到了 14個單突變蛋白,分別為OATP1B3-N528D、T529A、F535Y、I536F、Y537F、I543L、S545L、L546F、T550L、T554S、F555H、I556V、L557M和T559I。功能實驗表明,當OATP1B3在555位的氨基酸由芳香族苯丙氨酸突變成帶正電荷的組氨酸時,激動作用顯著降低。因此在野生型OATP1B3轉運體中45位的甘氨酸以及555位的苯丙氨酸是對小分子EGCG的激動起主要作用的氨基酸殘基。為了進一步將確定45和555位點氨基酸結構特征對OATP1B3激動的影響,我們將45位柔性最大的甘氨酸分別突變成含有羥基的絲氨酸、芳香族的苯丙氨酸、帶負電的天冬氨酸、帶正電的賴氨酸,得到1B3-G45S,1B3-G45F,1B3-G45D,1B3-G45K;同樣類似地,將555位的苯丙氨酸突變成芳香族色氨酸與酪氨酸,得到1B3-F555W,1B3-F555Y。功能實驗表明,當45位的甘氨酸突變成以上氨基酸時,小分子調節(jié)劑EGCG對OATP1B3的激動作用也是顯著降低的,說明45位的甘氨酸柔性可能是發(fā)揮激動作用的關鍵因素。當555位芳香族的苯丙氨酸突變成帶正電荷組氨酸時,EGCG對OATP1B3的激動顯著降低,而當555位的苯丙氨酸突變成不帶電荷的芳香族氨基酸色氨酸與酪氨酸時,EGCG對OATP1B3仍起激動作用。以上結果表明,555位的正電荷不利于OATP1B3的激動。
【圖文】：

有組氨酸的氨基酸序列）的作用下合成片段２，新合成的片段１與片段２具有部分互逡逑補序列，最后在引物１與引物４的作用下，進行第二輪ＰＣＲ，，最終合成目的蛋白，逡逑原理如下圖２－１所示。逡逑Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ邋ＰＣＲ逡逑Ｃｈｉｍｅｒａ邋１邋ｌ邐＾逡逑Ｐｎｍｅｒｌ＾邋ＯＡＴＰ１Ｂ１邐ＰｎｍｅｒＳ＾邋ＯＡＴＰ１Ｂ３逡逑Ｉ邐Ｉ逡逑４＾邋Ｐｒｉｒｎｅｒ２邐４１■卜逡逑；｜邐Ｐｒｉｍｅｒ邋４逡逑Ｉ邋Ｆｉｒｓｔ邋ｒｏｕｎｄ邋ＰＣＲ逡逑Ｐｒｉｍｅｒ邋１邋ｃｚｊ＞邐%煎義稀稿危簦殄鍉栧澹殄義暇礤澹校潁椋恚澹蟈澹村義希櫻澹悖錚睿溴澹潁錚酰睿溴澹校茫義義希殄危義希茫瑁椋恚澹潁徨澹卞義賢跡玻保氐校茫業(yè)腦磽煎義希疲椋紓澹玻保澹裕瑁邋澹穡潁椋睿悖椋穡歟邋澹錚駑澹錚觶澹潁歟幔穡穡椋睿玨澹校茫遙義先緩蠼菇ê玫哪康幕蛟冢模危亮用傅淖饔孟虜迦耄穡悖模危粒擔疲遙緣目瞻自靨邋義希峰義

本文編號：2662414