【摘要】：背景隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展,納米材料在腫瘤診斷和治療的研究中備受矚目。普魯蘭多糖因其良好生物相容性,常用作納米藥物輸送載體材料。與正常細(xì)胞相比,生物素對(duì)于腫瘤的增殖必不可少且生物素受體在腫瘤細(xì)胞表面高度過表達(dá),可以作為配體與納米藥物偶聯(lián)達(dá)到主動(dòng)靶向腫瘤的作用。根據(jù)課題組前期研制的乙酰普魯蘭多糖納米藥物載體的基礎(chǔ)上,我們合成了生物素乙酰普魯蘭多糖(BiotinConjugated Pullulan Acetate,Bio-PA),并制備生物素化乙酰普魯蘭多糖納米粒(Bio-PA NPs),考察其作為靶向抗腫瘤藥物載體的可行性。目的1.探索并制備的Bio-PA NPs作為抗腫瘤藥物載體的可行性;2.闡明Bio-PA NPs作為靶向抗腫瘤藥物載體的體內(nèi)外作用機(jī)制;3.探索體外三維肝腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)及建立體內(nèi)皮下移植瘤模型的方法,評(píng)價(jià)三維培養(yǎng)模型的優(yōu)勢(shì),用于評(píng)價(jià)Bio-PA NPs體內(nèi)抑瘤效應(yīng)。方法1.納米粒的制備及理化性質(zhì)表征。合成PA及Bio-PA,并通過核磁共振譜儀對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。使用透析法以及溶劑揮發(fā)法制備空白及載藥納米粒,通過粒徑分析儀測(cè)量納米粒的粒徑及其表面電勢(shì),透射電鏡TEM觀察納米粒的形態(tài),通過高效液相色譜測(cè)定載藥納米粒的載藥量及藥物的體外釋放量,并通過生物素定量測(cè)定試劑盒測(cè)定納米粒表面生物素的取代度及含量。2.納米粒的體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)。選擇生物素受體高表達(dá)的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞和人肝癌HepG2細(xì)胞,生物素受體低表達(dá)的人腎上皮293T細(xì)胞三種細(xì)胞,通過CCK-8評(píng)價(jià)游離藥物EPI、空白納米粒和載藥納米粒對(duì)細(xì)胞增殖的影響,通過激光共聚焦及流式細(xì)胞分析儀對(duì)細(xì)胞攝取納米粒情況進(jìn)行定性、定量分析。3.向三種細(xì)胞加入特異性細(xì)胞吞噬抑制劑網(wǎng)格蛋白通道抑制劑氯丙嗪(CPZ)、溶酶體抑制劑氯喹(CQ)、巨胞飲抑制劑阿米洛利(AMR)、小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞抑制劑制霉素(NYS)、小窩蛋白介導(dǎo)的與膽固醇結(jié)合的攝取途徑抑制劑菲律賓菌素(FLP)和生物素(Biotin),通過流式細(xì)胞分析儀及熒光發(fā)光儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度,對(duì)其攝取量進(jìn)行定性及定量分析,并對(duì)細(xì)胞攝取納米粒的途徑進(jìn)行探討。4.觀察比較二維及三維細(xì)胞培養(yǎng)模式下HepG2細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征,通過向KM小鼠皮下注射二維及三維水凝膠的HepG2細(xì)胞,定期對(duì)其腫瘤大小及KM小鼠體重進(jìn)行測(cè)量,來觀察兩種方式的成瘤情況,并對(duì)體重進(jìn)行測(cè)定,通過組織切片對(duì)兩種模式所形成的腫瘤組織的形態(tài)進(jìn)行觀察。5.納米粒體內(nèi)分布及抑瘤實(shí)驗(yàn)。用Cy7標(biāo)記空白納米粒,通過光聲成像儀考察納米粒進(jìn)入荷瘤裸鼠體內(nèi)的藥物分布情況及其代謝情況;通過尾靜脈注射觀察荷瘤裸鼠腫瘤體積大小的變化來衡量其體內(nèi)抑瘤效應(yīng)。結(jié)果1.核磁圖譜表明我們成功合成了PA和Bio-PA。透射電鏡顯示兩種方法制備的納米粒均呈均勻的球形,無黏連。但與溶劑揮發(fā)法相比,透析法制備的納米粒無論是載藥量、包封率還是生物素的取代度、生物素含量均比較高,且粒徑均一,故后期選擇透析法制備納米粒。體外釋放實(shí)驗(yàn)表明載藥納米粒在pH5.5的PBS溶液中釋放的速度較pH 7.4的快,且前12 h釋放較快,后緩慢釋放。2.體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)表明濃度范圍為5-1000μg/mL的兩種空白納米粒與三種細(xì)胞共孵育24 h和48 h,對(duì)細(xì)胞的增殖沒有顯著影響。載藥納米粒和游離藥物EPI分別以0.025、0.25、2.5、10和25μg/mL與三種細(xì)胞共孵育24 h和48 h后發(fā)現(xiàn)BioPA/EPI NPs和PA/EPI NPs對(duì)細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒性且Bio-PA/EPI NPs效果最佳,說明其具有良好的體外抑瘤效果。細(xì)胞攝取途徑研究表明網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑是細(xì)胞攝取納米粒的主要途徑,加入游離生物素后,MCF-7和HepG2細(xì)胞對(duì)納米粒的攝取減少為62.4%和60.5%,而293T細(xì)胞沒有顯著變化。3.通過顯微鏡圖及激光共聚焦圖的結(jié)果表明,HepG2細(xì)胞在三維水凝膠中呈球形生長(zhǎng)且能形成細(xì)胞團(tuán),增加細(xì)胞之間的相互聯(lián)系。動(dòng)物成瘤實(shí)驗(yàn)表明三維模式下成瘤速度約為二維細(xì)胞模式下的2倍,體重變化比較穩(wěn)定且沒有出現(xiàn)動(dòng)物死亡情況。4.以Cy7為對(duì)照,尾靜脈注射Cy7-PA和Cy7-Bio-PA,用光聲成像儀觀察腫瘤部位發(fā)現(xiàn)12h后游離Cy7熒光消失,Cy7-PA和Cy7-Bio-PA直到24 h仍有熒光,且Cy7-Bio-PA顯著強(qiáng)于Cy7-PA,說明納米粒具有靶向性和長(zhǎng)循環(huán)性。體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Bio-PA/EPI NPs顯著抑制腫瘤生長(zhǎng),并且平均腫瘤體積顯著小于對(duì)照組、PA/EPI NPs治療組和EPI組。結(jié)論1.成功合成Bio-PA并制備了Bio-PA NPs,納米粒粒徑均一,形態(tài)圓整,具有較高的包封率和載藥量,EPI的體外釋放具有緩釋性。2.空載納米粒在一定濃度范圍內(nèi)無明顯細(xì)胞毒性,Bio-PA/EPI NPs與PA/EPI NPs和EPI相比,生物素高表達(dá)的細(xì)胞攝取量增加且體外抑瘤效果顯著增強(qiáng)。3.3D水凝膠培養(yǎng)易于形成細(xì)胞團(tuán),縮短建立體內(nèi)皮下移植瘤模型時(shí)間,可以用于動(dòng)物皮下移植瘤模型的建立。體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)表明Bio-PA NPs具有優(yōu)良的腫瘤組織靶向性和抑瘤效應(yīng)。4.綜上所述,Bio-PA NPs在體內(nèi)與體外均表現(xiàn)出良好的藥物緩釋性、長(zhǎng)循環(huán)性和腫瘤靶向性,具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景,有望成為一種新的藥物輸送體系。
【圖文】：

圖 3. 不同保存時(shí)間下 Bio-PA納米圖注：（A）Bio-PANPs 的粒徑、 Zeta電Figure 3. The changes of the size, the Zeta potentthe stNote: (A) Changes in particle size, Zeta potentiaP2.4 Bio-PA/EPI 納米粒的體外藥物釋為了觀察藥物從納米粒中釋放情況7.4）條件的 PBS 中記錄藥物的釋放，EP4 所示。在 12 h 時(shí) EPI 具有較快的釋放pH 7.4 條件下 EPI 的累積釋放量為 5266.4%。在相同時(shí)間內(nèi)，pH 5.5 條件下 E中，磷酸鹽類的藥物更易溶解，，促進(jìn)納米

27 Bio-PA/EPI NPs 孵育 2 h 后，HepG2、MCF-7 和 293T 細(xì)胞對(duì)納米粒攝取情況的激光聚焦圖和流式結(jié)果e 6. Confocal image (A) and FACS results (B) of HepG2, MCF-7 and 293T cells incubated wiBio-PA /EPI NPs for 2 h (scale bar is 20 μm).io-PA/EPI 納米粒的細(xì)胞攝取機(jī)制研究了研究 Bio-PA/EPI NPs 的細(xì)胞攝取途徑，我們將三種細(xì)胞 HepG2、MCF-7胞分別與不同的攝取抑制劑作用，CPZ（網(wǎng)格蛋白通道抑制劑）、CQ（內(nèi)酶體抑制劑）、AMR（巨胞飲抑制劑）、NYS（小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞抑
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R943

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 Guang Huang;Qing-Qing Meng;Wen Zhou;Qi-Jing Zhang;Jin-Yun Dong;Shao-Shun Li;;Design and synthesis of biotinylated dimethylation of alkannin oxime derivatives[J];Chinese Chemical Letters;2017年02期

2 丁媛媛;田寶成;韓景田;;聚合物膠束作為抗腫瘤藥靶向給藥體系的研究進(jìn)展[J];中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志;2015年08期

3 王明芳;張娜;;共遞送抗癌藥多柔比星和基因的納米載藥系統(tǒng)研究進(jìn)展[J];中國(guó)新藥與臨床雜志;2014年10期

4 王持;潘仕榮;吳紅梅;溫玉婷;曾昕;馮敏;;聚酰胺-胺樹枝狀高分子的聚乙二醇改性及作為基因載體的性能[J];藥學(xué)學(xué)報(bào);2011年01期

5 陳紅麗;唐紅波;楊文智;陳漢;王銀松;梅林;張彤;熊青青;張其清;;生物素化殼聚糖修飾的PLGA納米粒的制備及表征[J];高等學(xué)�；瘜W(xué)學(xué)報(bào);2010年08期

本文編號(hào)：2661806