【摘要】：背景鎘(Cd)及其化合物是當(dāng)前環(huán)境中的常見(jiàn)重金屬污染物,主要來(lái)源于工農(nóng)業(yè)的生產(chǎn)和應(yīng)用。腎臟作為鎘的主要蓄積部位之一,腎近曲小管的Sl段及S2段是鎘毒性的主要靶標(biāo)。氯化鎘(CdCl_2)對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞(human renal tubular epithelial cells,HK-2)毒性損傷的影響機(jī)制至今尚無(wú)定論。線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)和功能的紊亂,可能是鎘致腎細(xì)胞毒性損傷的早期靶點(diǎn)。作為核轉(zhuǎn)錄輔助激活因子的過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子(PGC-1α),可增強(qiáng)核受體及相關(guān)轉(zhuǎn)錄蛋白的活性,在線(xiàn)粒體生物合成和線(xiàn)粒體功能中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用,但PGC-1α以及PGC-1α參與的相關(guān)轉(zhuǎn)錄蛋白NRF-1在CdCl_2致HK-2細(xì)胞線(xiàn)粒體毒性損傷中的作用尚不清楚。目的探討氯化鎘對(duì)HK-2細(xì)胞線(xiàn)粒體功能、PGC-1?和NRF-1蛋白表達(dá)的影響,以及氯化鎘對(duì)HK-2細(xì)胞線(xiàn)粒體氧化損傷的可能機(jī)制。方法1.體外培養(yǎng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK-2細(xì)胞,分別暴露于0、10、20、30、40、50、60?mol/L的氯化鎘培養(yǎng)基中,以未加氯化鎘藥物作為對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)24h后,使用四唑鹽(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法檢測(cè)細(xì)胞的活力。2.采用共聚焦顯微鏡觀(guān)察MitoSOX?活細(xì)胞熒光染色線(xiàn)粒體ROS生成情況,并用熒光定量分析線(xiàn)粒體ROS平均熒光密度值的變化。3.提取細(xì)胞線(xiàn)粒體,采用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定線(xiàn)粒體蛋白中線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合物III,即輔酶Q-細(xì)胞色素C還原酶(ubiquinol cytochrome c oxidoreductase)的活性。4.JC-1染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位的變化。5.Western blot法檢測(cè)細(xì)胞總蛋白中PGC-1αNRF-1蛋白表達(dá)的情況。結(jié)果1.經(jīng)不同濃度氯化鎘處理HK-2細(xì)胞24小時(shí)后,對(duì)照組(0μmol/L)相比,當(dāng)氯化鎘濃度為10?mol/L時(shí),細(xì)胞的存活率的下降無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.089);氯化鎘濃度增加到20?mol/L,細(xì)胞存活率下降為(77.60±0.8185)%(P0.01);氯化鎘濃度增加為60?mol/L時(shí),細(xì)胞的存活率下降為(41.96±1.2220)%(P0.01);并呈明顯的劑量依賴(lài)相關(guān)性。2.細(xì)胞經(jīng)不同濃度氯化鎘干預(yù)24小時(shí)后,與對(duì)照組相比,共聚焦顯微鏡觀(guān)察HK-2細(xì)胞中MitoSOX染色紅色熒光逐步增強(qiáng);經(jīng)熒光定量分析發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,氯化鎘濃度20?mol/L時(shí),線(xiàn)粒體ROS平均熒光密度值的增高已具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);氯化鎘濃度為30~60?mol/L時(shí),平均熒光密度值增高的趨勢(shì)更為明顯(P0.01)。3.細(xì)胞經(jīng)不同濃度氯化鎘干預(yù)24小時(shí)后,與對(duì)照組相比,氯化鎘濃度為20?mol/L時(shí),線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合物III的活性下降已具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);氯化鎘濃度為40~60?mol/L時(shí),線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合物III的活性顯著下降(P0.01)。4.細(xì)胞經(jīng)不同濃度氯化鎘干預(yù)24小時(shí)后,隨著氯化鎘從低到高濃度的增加,JC-1單體陽(yáng)性率呈逐步上升趨勢(shì)。與對(duì)照組相比,20~60?mol/L的氯化鎘濃度組JC-1單體陽(yáng)性率的相對(duì)比值分別為:1.5100±0.1353、1.5800±0.1670、1.7167±0.1305、2.4100±0.1539、3.4733±0.2702(P0.01),提示線(xiàn)粒體膜電位逐步下降。5.細(xì)胞經(jīng)不同濃度氯化鎘干預(yù)24小時(shí)后,氯化鎘濃度為20?mol/L時(shí),HK-2細(xì)胞總蛋白中PGC-1?蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),CdCl_2為30~60?mol/L時(shí),PGC-1?蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P0.01);CdCl_2濃度為20~60?mol/L,與對(duì)照組相比,HK-2細(xì)胞總蛋白中NRF-1蛋白相對(duì)表達(dá)量呈逐步下降趨勢(shì)(P0.01)。結(jié)論1.氯化鎘濃度在20~60?mol/L染毒HK-2細(xì)胞24小時(shí)后,可抑制細(xì)胞的存活率,且呈劑量反應(yīng)關(guān)系。2.氯化鎘可能與通過(guò)抑制HK-2細(xì)胞中PGC-1αNRF-1蛋白的表達(dá),引起線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合物III的活性下降,促進(jìn)線(xiàn)粒體ROS的聚集,誘發(fā)線(xiàn)粒體膜電位的下降具有相關(guān)性,造成對(duì)HK-2細(xì)胞的毒性損傷。
【圖文】：

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文況。作為細(xì)胞能量和 ROS 的主要來(lái)源，線(xiàn)粒體也在各種細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑和維細(xì)胞代謝中發(fā)揮重要作用。Oh 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，，鎘可與線(xiàn)粒體內(nèi)膜上含巰基的蛋結(jié)合，抑制呼吸鏈中酶的活性，引起線(xiàn)粒體呼吸鏈功能障礙和 ROS 的增加。近Song[14]等研究指出，鎘暴露可使原代近端腎小管上皮細(xì)胞線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換（MPTP）開(kāi)放，破壞線(xiàn)粒體超微結(jié)構(gòu)，引起線(xiàn)粒體凋亡蛋白和因子的激活，以多聚 ADP-核糖聚合酶（PARP）的切割，葛根素可通過(guò)恢復(fù)膜電位來(lái)影響 ATP 產(chǎn)生并通過(guò)調(diào)節(jié) ANT-1 和 ANT-2 的表達(dá)水平以改善鎘誘導(dǎo)的 ATP 消耗。我們推測(cè)對(duì)粒體功能的保護(hù)有望成為鎘致腎毒性防治的新靶點(diǎn)。

Yuan 等[17]研究發(fā)現(xiàn)阿霉素對(duì)心肌細(xì)胞毒性損傷中，PGC-1α介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)能涉及以下三個(gè)方面，在線(xiàn)粒體氧化損傷和生物能量平衡中發(fā)揮重要作用：加速 TCA 循環(huán)和 -氧化，提供更多 NADH 作為電子供體進(jìn)入 ETC 電子傳遞調(diào)節(jié) ROS 的水平；（3）促進(jìn)線(xiàn)粒體的生物合成。范飛研究[18]發(fā)現(xiàn)對(duì) MPP+SH-SY5Y 細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)，是由于激活的 SIRT1 可通過(guò)活化 PGC-1αROS 產(chǎn)生。Fu 等[19]發(fā)現(xiàn)，鎘暴露于小鼠腎小管上皮細(xì)胞(TCMK-1)中，F(xiàn)OXO3a 與 PGC1α和超氧化物歧化酶 2(SOD2)啟動(dòng)子的結(jié)合親和力降低。白通過(guò)促進(jìn)線(xiàn)粒體內(nèi) SIRT3 的富集及 FOXO3a 介導(dǎo)的線(xiàn)粒體 PGC-1α和 SOD2達(dá)的上調(diào)，顯著降低線(xiàn)粒體 ROS 的生成，提示可能是通過(guò)對(duì) SIRT3/ FoxO3a路的活化介導(dǎo)。金鵬等[20]研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素可能通過(guò)抑制 PPARα/PGC-1α軸降低 H9c2 心肌細(xì)胞內(nèi)高能磷酸化合物含量，提示 PPARα/ PGC-1α軸表達(dá)的通過(guò)提高能量合成來(lái)保護(hù) H9c2 心肌細(xì)胞。
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R99

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2656121