【摘要】：目的:應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)抑制人黑色素瘤A375細(xì)胞CBP、Nrf2基因表達(dá),研究CBP、Nrf2基因沉默后對A375細(xì)胞的影響,從而為開發(fā)新型的核酸藥物奠定一定的基礎(chǔ)。方法:1、針對CBP、Nrf2基因mRNA序列分別設(shè)計(jì)合成1對特異性CBP siRNA和3對特異性Nrf2 siRNA,采用脂質(zhì)體高效轉(zhuǎn)染試劑LipoHigh介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染到黑色素瘤A375細(xì)胞。2、實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)用于檢測轉(zhuǎn)染48h后CBP、Nrf2基因的mRNA表達(dá)水平。3、siRNA轉(zhuǎn)染后,采用CCK-8試劑盒檢測A375細(xì)胞的增殖能力。4、碧云天活性氧試劑盒測定各組細(xì)胞ROS含量。5、采用PI染色結(jié)合流式細(xì)胞儀測定CBP、Nrf2 siRNA對A375細(xì)胞的周期分布。6、采用Annexin V-FITC/PI染色結(jié)合流式細(xì)胞儀測定CBP、Nrf2 siRNA對A375細(xì)胞的凋亡率。7、采用光學(xué)顯微鏡、DAPI染色檢測不同時間點(diǎn)細(xì)胞或細(xì)胞核形態(tài)的變化。結(jié)果:1、Real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白對照組相比,CBP siRNA和Nrf2 siRNA實(shí)驗(yàn)組中的CBP、Nrf2基因的表達(dá)量降低(P0.05)。2、A375細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同劑量的CBP siRNA、Nrf2 siRNA后,CCK-8結(jié)果顯示,抑制CBP、Nrf2基因后,隨著siRNA劑量的增加,細(xì)胞增殖率降低。3、A375細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同劑量的CBP siRNA、Nrf2 siRNA后,ROS結(jié)果顯示,CBP siRNA、Nrf2 siRNA均使細(xì)胞內(nèi)ROS含量升高,且共轉(zhuǎn)染組比單轉(zhuǎn)染組ROS升高的更明顯。4、CBP siRNA使G2/M期比例下降(P0.05);Nrf2 siRNA可使A375細(xì)胞周期阻滯于S期(P0.05);共轉(zhuǎn)染CBP、Nrf2 siRNA后使細(xì)胞發(fā)生S期阻滯。5、隨著CBP siRNA(Nrf2 siRNA)劑量的增加,正常細(xì)胞比例較少,晚期凋亡數(shù)量增加,且與轉(zhuǎn)染劑量有一定依賴關(guān)系。6、光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),空白對照組、陰性對照組細(xì)胞呈貼壁生長,細(xì)胞體積較大,隨著培養(yǎng)時間的增加,細(xì)胞數(shù)逐漸增多。經(jīng)CBP siRNA轉(zhuǎn)染4h后細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)空泡化,隨著培養(yǎng)時間的增加,細(xì)胞數(shù)減少。共聚焦熒光顯微鏡下觀察,經(jīng)CBP siRNA轉(zhuǎn)染36h后細(xì)胞出現(xiàn)核固縮,核降解。經(jīng)Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染后可見部分細(xì)胞皺縮脫壁,胞間隙增大,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則。共聚焦熒光顯微鏡下觀察,經(jīng)Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞出現(xiàn)染色質(zhì)聚集,染色加深,核降解。共轉(zhuǎn)染CBP、Nrf2 siRNA后,細(xì)胞形態(tài)縮小,細(xì)胞質(zhì)凝縮。共聚焦熒光顯微鏡下觀察,共轉(zhuǎn)染組在48h逐漸核降解消失。結(jié)論:1、CBP siRNA使腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS升高,造成細(xì)胞質(zhì)空泡化,這時的細(xì)胞并沒有完全處于死亡,而是隨著CBP siRNA轉(zhuǎn)染時間的增加,細(xì)胞核出現(xiàn)染色質(zhì)異常壓縮,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。2、Nrf2 siRNA使腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS升高,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡。主要通過影響細(xì)胞周期S期向G2/M期的轉(zhuǎn)變過程,將腫瘤細(xì)胞阻滯在S期,減少進(jìn)入G2/M期的細(xì)胞數(shù)目,從而抑制腫瘤增殖。3.共轉(zhuǎn)染CBP、Nrf2 siRNA介導(dǎo)ROS大量產(chǎn)生,同時使細(xì)胞發(fā)生S期阻滯,促進(jìn)細(xì)胞死亡。CBP并不是只參與Keap1-Nrf2-ARE途徑調(diào)節(jié)ROS,也可能參與其他途徑調(diào)節(jié)ROS水平。
【圖文】：

組之間的CBP mRNA無差異（P＞0.05（）見表2-1，圖2-1）。說P 表達(dá)。表 2-1 各組 CBP 基因 mRNA 表達(dá)水平（ x s，n=3）CBP mRNA 表達(dá)量l 0.989 0.044iRNA(1fmol/cell) 0.710 0.073*iRNA(2fmol/cell) 0.614 0.074**iRNA(3fmol/cell) 0.507 0.085**NA 0.967 0.03921.1100.000照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

隨著 CBP siRNA 劑量的增加，細(xì)胞增殖率降低（P＜0.01）胞增殖率與空白對照組相比，，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.0表 2-2 各組細(xì)胞增殖能力的比較（ x s，n=3）增殖率（%） 99.653 5.181NA(1fmol/cell) 83.266 6.831*NA(2fmol/cell) 72.906 4.701**NA(3fmol/cell) 55.418 8.694**NA 98.000 4.00036.2800.000照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
【學(xué)位授予單位】：河北大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R965

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1 羅振革,高杰英,李紅,彭虹,朱錫華;CD44單克隆抗體對人黑色素瘤細(xì)胞的體內(nèi)外生物學(xué)特性的影響[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;1996年05期

2 王結(jié)義;王龍生;宋家g

本文編號：2627890