發(fā)布時間：2020-03-22 05:33

【摘要】：目的：研究人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)上清對正常人外周血單個核細胞（PBMC）各淋巴細胞亞群比例的影響；探究人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)上清對誘導活化后的PBMC殺傷腫瘤細胞功能的影響。 方法: 一．人臍帶間充質干細胞的分離、培養(yǎng)和生物學特性研究。 利用組織塊貼壁法分離人臍帶間充質干細胞并利用傳代純化篩選出能穩(wěn)定傳代培養(yǎng)的hUC-MSC；倒置熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)；流式細胞術（FCM）檢測hUC-MSCs的免疫表型；應用不同因子誘導hUC-MSCs向成骨細胞、成軟骨細胞和脂肪細胞分化并進行鑒定。 二． hUC-MSCs對正常人外周血單個核細胞（PBMC）各淋巴細胞亞群比例的影響的研究。 通過密度梯度離心法分離PBMC，加入OKT3刺激，，用含有hUC-MSCs培養(yǎng)上清的條件培養(yǎng)基（MSC-CM）處理PBMC， FCM分析比較處理組和對照組各淋巴細胞亞群比例以及周期的變化；Annexin V/PI雙染確定PBMC的凋亡情況；ELISA法檢測MSC-CM對PBMC分泌IFN-γ、IL-10的影響。 三． PGE2參與hUC-MSCs對Treg亞群比例的調節(jié)并影響PBMC的增殖活性。 在hUC-MSCs的培養(yǎng)體系中加入PGE2拮抗劑NS-398并收集培養(yǎng)2~3d后的hUC-MSC上清。用含此時收集的hUC-MSC上清的條件培養(yǎng)基作用于PBMC，作為實驗組，用含未處理過的hUC-MSCs培養(yǎng)上清的條件培養(yǎng)基作用于PBMC，作為對照組1，用正常DMEM/F12培養(yǎng)基作用于PBMC，作為對照組2。FCM分析比較實驗組和各對照組PBMC中Treg比例的變化；ELISA法檢測比較實驗組和各對照組PBMC分泌IFN-γ、IL-10的水平。 四． hUC-MSCs上清與CIK及腫瘤細胞A549共培養(yǎng)體系的相互作用研究。 密度梯度離心法分離PBMC，并誘導培養(yǎng)CIK細胞，流式細胞術檢測CIK細胞免疫表型；流式細胞術檢測hUC-MSCs培養(yǎng)上清作用后A549細胞周期的變化，MTT法檢測A549細胞增殖曲線；MTT法檢測hUC-MSCs培養(yǎng)上清對CIK殺傷A549細胞的影響。 結果：成功分離得到人臍帶間充質干細胞，體外培養(yǎng)細胞貼壁、呈長梭形，形態(tài)均一，高表達基質細胞標志CD73、CD105、CD44、CD29和黏附分子CD90，不表達CD14、MHCⅡ類分子HLA-DR和造血干細胞表面標志CD34、CD45，Gomori鈣鈷法、油紅O染色和阿利辛藍染色證實分離所得臍帶間充質干細胞可誘導分化為成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞；MSC-CM下調了CD4+/CD8+T細胞比值，上調了PBMC中CD4+CD25+CD127lowTreg細胞的含量，而對其他淋巴細胞亞群的比例無顯著影響，抑制了PBMC分泌IFN-γ的能力，但對IL-10的分泌有促進作用，此外，MSC-CM對PBMC有保護作用，降低了PBMC在OKT3刺激下的凋亡程度。抑制劑NS-398的加入使MSC-CM上調Treg的能力下降，同時也抑制了上調PBMC分泌IL-10的能力，且使PBMC分泌IFN-γ的水平得到恢復，NS398抑制試驗確定了PGE2是人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)上清發(fā)揮免疫抑制效應的介導因子；殺傷試驗證實人臍帶間充質干細胞對CIK的殺傷功能具有抑制作用，且此抑制作用可能被血清中和。 結論：人臍帶間充質干細胞的免疫抑制效應可不依賴于與免疫細胞的直接或間接接觸，并且與誘導免疫細胞凋亡無關，通過可溶性因子PGE2促進Treg細胞的增殖和活化可能是人臍帶間充質干細胞發(fā)揮其免疫抑制功能的途徑之一，且此種抑制效應能夠降低CIK細胞對肺腺癌A549細胞的殺傷功能。
【圖文】：

3 結果3.1 hUC-MSCs 的分離培養(yǎng)和形態(tài)學觀察通過組織塊法分離培養(yǎng)人臍帶間充質干細胞，可在分離培養(yǎng)的 10d 內于倒置顯下觀察到呈梭行、多角形或短桿狀的貼壁細胞從組織塊周圍爬出（圖 1.A）。10胞增長速度逐漸加快，向遠離組織塊方向呈放射狀生長，細胞逐增生為形態(tài)均

圖 2. hUC-MSCs 的免疫表型檢測Fig2. The test of immunophenotype of hUC MSCs hUC-MSCs 的分化潛能和鑒定.1 向成骨細胞誘導及其鑒定在成骨定向誘導培養(yǎng)過程中，觀察到誘導細胞體積逐漸增大，細胞間隙逐漸細胞形態(tài)逐漸由長梭形向短梭形、鱗片型、多角形等形態(tài)轉變，且常伴有短相連，輪廓清晰，多位于細胞的游離端。誘導后期可觀察到細胞中部出現(xiàn)結，部分細胞層疊生長，細胞胞漿中形成大小不一的顆粒沉積，而對照組仍為形細胞形態(tài)，胞漿中也無顆粒沉積（圖 3.A）。經 Gomori 鈣鈷法染色顆粒會到棕黑色（圖 3.B），大部分細胞染色呈陽性，符合成骨細胞的特征，由此我分離所得 hUC-MSCs 具有向成骨細胞分化的能力。.2 向脂肪細胞誘導及其鑒定在成脂定向誘導培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)加入成脂誘導液后細胞幾乎停止增長，5
【學位授予單位】：廣東藥學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R96

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 ;Transplantation of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell Ameliorates the Autoimmune Pathogenesis in MRL/lpr Mice[J];Cellular & Molecular Immunology;2008年06期

2 肖燕妮;張曦;劉耀;張根玲;曾鈺竹;苗瑩瑩;李忠俊;;臍血間充質干細胞治療GVHD的效果(附5例異基因造血干細胞移植術后GVHD的治療)[J];中國輸血雜志;2013年04期

本文編號：2594569