【摘要】：基于脂質(zhì)納米粒的小干擾RNA(siRNA)遞送系統(tǒng)對(duì)腫瘤等多種疾病有著良好的治療效果。傳統(tǒng)的脂質(zhì)體制備方法多依賴于宏觀尺度的混合,步驟繁瑣且重復(fù)性差。微流控技術(shù)(Microfluidic)可以實(shí)現(xiàn)微米尺度下流體的精確操控,從而優(yōu)化載體制備過(guò)程。然而,由于微流控芯片中流體處于層流狀態(tài),較低的混和效率制約了其在該領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展。本課題中,我們?cè)O(shè)計(jì)了一種通道底部嵌有w狀溝槽的微流控芯片。通道內(nèi)的w狀溝槽誘發(fā)液流發(fā)生混沌現(xiàn)象,極大增加了兩相間接觸面積,使得高效的混合在數(shù)微秒內(nèi)即可完成。課題隨后通過(guò)芯片制備了小粒徑、單分散的轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin,Tf)修飾脂質(zhì)納米粒,并從體外和體內(nèi)水平對(duì)其遞送siRNA的能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)。論文主要研究方法和結(jié)果如下:1.芯片設(shè)計(jì)及納米粒制備表征本課題在PDMS芯片中加工200×75μm的矩形微通道,并在通道底部刻蝕w狀溝槽,溝槽深35μm,寬50μm。由熒光混合效率實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)微通道內(nèi)流體的混沌現(xiàn)象被成功誘發(fā)。為優(yōu)化所設(shè)計(jì)微芯片制備脂質(zhì)納米粒的條件,本論文對(duì)微通道內(nèi)總流體流速(total flow rate,TFR),水脂相流速比(flow rate ratio,FRR)和磷脂濃度三因素組合進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明,微流控芯片在磷脂濃度為5 mg/ml,TFR為735μl/min,FRR為20時(shí)制備的轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾脂質(zhì)納米粒(microfluidic prepared transferrin lipid nanoparticles,M-Tf-LNPs)各參數(shù)最佳。此時(shí)M-Tf-LNPs平均粒徑為110 nm,多分散系數(shù)(PDI)為0.15,比批量式(Bulk)乙醇注入法所制備的同處方納米粒(B-Tf-LNPs)粒徑小90 nm左右,PDI小0.12。室溫存放7天后,M-Tf-LNPs的粒徑分布未發(fā)生明顯變化。2.M-Tf-LNPs的體外抗腫瘤效果評(píng)價(jià)課題隨后對(duì)所制備納米粒的體外安全性、細(xì)胞攝取效率和轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行了評(píng)價(jià)。MTT實(shí)驗(yàn)表明,加入M-Tf-LNPs空白載體培養(yǎng)24 h后,Hep G2細(xì)胞活力保持在90%以上,說(shuō)明其良好的體外安全性。流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果表明,M-Tf-LNPs包載的FAM-siRNA可以在4小時(shí)內(nèi)被細(xì)胞快速攝取。激光共聚焦顯微鏡觀察可見(jiàn),經(jīng)M-Tf-LNPs介導(dǎo)內(nèi)化的siRNA主要分布于細(xì)胞質(zhì)中。Western blot評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后蛋白敲除效率,結(jié)果顯示經(jīng)M-Tf-LNPs遞送的siRNA可以有效降低Hep G2細(xì)胞中的survivin蛋白表達(dá)。3.M-Tf-LNPs的體內(nèi)抗腫瘤效果評(píng)價(jià)為評(píng)價(jià)M-Tf-LNPs在體內(nèi)的siRNA遞送效率,本文構(gòu)建移植瘤小鼠模型并給以尾靜脈注射納米粒,以考察其體內(nèi)組織分布情況、腫瘤生長(zhǎng)抑制效率及體內(nèi)生物安全性。組織熒光分布實(shí)驗(yàn)表明,包載Cy3-siRNA的M-Tf-LNPs在注射2小時(shí)后即開(kāi)始于腫瘤部位蓄積,且在給藥24小時(shí)后仍有較高的信號(hào)強(qiáng)度,這說(shuō)明其良好的腫瘤靶向性并能有效延長(zhǎng)si RNA的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間。開(kāi)始給藥后,定期記錄繪制腫瘤體積變化曲線并在周期結(jié)束后稱量瘤重。結(jié)果顯示,M-Tf-LNPs組可以有效抑制腫瘤體積增長(zhǎng),抑制率達(dá)到73%。小鼠體重變化的情況顯示治療組體重變化幅度小于15%;病理切片結(jié)果表明,相比注射生理鹽水的對(duì)照組,MTf-LNPs組小鼠給藥結(jié)束后主要器官?zèng)]有發(fā)生明顯的組織病變和異常,這些結(jié)果說(shuō)明M-Tf-LNPs在模型小鼠體內(nèi)有良好的生物安全性。綜上所述,本課題所設(shè)計(jì)的w溝槽型微流控芯片具有良好的流體混合效率。相比乙醇注入法,基于w型芯片制備脂質(zhì)納米粒的工藝簡(jiǎn)單、快速,重復(fù)性好,所制備的納米粒粒徑適宜,分散單一,在體外體內(nèi)均能高效遞送siRNA進(jìn)入細(xì)胞,降低survivin蛋白表達(dá),起到抑制腫瘤體積增長(zhǎng)的效果。
【圖文】：

w型芯片，在熒光顯微鏡下觀察其混合效率。結(jié)果如圖2.3所示：圖2.3芯片三通道入口處混合效果示意圖由圖可見(jiàn)，因?yàn)樵谖⑼ǖ纼?nèi)液體處于層流狀態(tài)，在三入口匯流處被兩側(cè)鞘液擠壓的中心液流有著清晰的兩相邊界。而隨著流體進(jìn)入帶有w溝槽的混合通道，呈黃色熒光的中心液流迅速向通道內(nèi)其余部位分散。這說(shuō)明混沌現(xiàn)象被成功誘發(fā)，，中心液流在層流狀態(tài)實(shí)現(xiàn)與周邊液流的快速混合。2.3.3納米粒制備條件優(yōu)化為優(yōu)化納米粒制備條件，課題通過(guò)DesignExpert軟件進(jìn)一步探討TFR、FRR和磷脂濃度對(duì)納米粒性質(zhì)的影響。以上述三因素為組合條件，以粒徑和PDI為響應(yīng)值進(jìn)行了Box-Behnken設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及動(dòng)態(tài)光散射法所獲得的結(jié)果列于表2.1。

圖以粒徑大小為軸響應(yīng)參數(shù)繪制的響應(yīng)面曲線圖。水平坐標(biāo)和為FRR和磷脂溶液濃度由圖2.5可知，在磷脂濃度一定的情況下，TFR與FRR之間具有良好的相關(guān)性，可以通過(guò)兩者的組合有效地控制粒徑大小。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R943

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本文編號(hào)：2587890