【摘要】：目的:(1)觀察二甲雙胍聯(lián)合柔紅霉素對人結(jié)腸癌細胞(SW480)的增殖抑制作用及促進細胞凋亡作用,并探討其可能的作用機制。(2)觀察二甲雙胍聯(lián)合柔紅霉素對人結(jié)腸癌細胞(SW480)荷瘤裸鼠的抑瘤作用。方法:(1)體外培養(yǎng)SW480結(jié)腸癌細胞,通過MTT法檢測不同濃度二甲雙胍(2.5、5、10、20、40、80 mmol·L-1)、柔紅霉素(0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8?mol·L-1)以及不同濃度二甲雙胍(2.5、5、10、20、40、80 mmol·L-1)聯(lián)合柔紅霉素(0.2?mol·L-1)在不同時間(24h、48h、72h)對結(jié)腸癌SW480細胞增殖的影響,確定藥物的濃度和作用時間。實驗分為四組:空白組,二甲雙胍組(20mmol·L-1),柔紅霉素組(0.2?mol·L-1),二甲雙胍與柔紅霉素聯(lián)合用藥組(20mmol·L-1+0.2?mol·L-1),藥物作用24h后檢測相應指標:(1)MTT法檢測細胞存活率;(2)集落克隆形成法檢測細胞集落克隆形成情況;(3)碘化丙啶(propidium iodide,PI)單染及Annexin V/PI雙染法檢測細胞的凋亡率;(4)Western blot檢測Bax、Bcl-2蛋白的表達;(5)RT-PCR檢測細胞Bcl-2、Bax mRNA變化。(2)動物實驗使用人結(jié)腸癌SW480細胞,建立移植腫瘤裸鼠模型:選取5-6周健康裸鼠,待細胞生長至對數(shù)期時,調(diào)整細胞濃度為1×107/ml,每只裸鼠左側(cè)腋窩下注射細胞懸液0.2ml,將40只荷瘤小鼠隨機分為4組:模型組(生理鹽水NS),二甲雙胍組(100mg·kg-1),柔紅霉素組(0.1mg·kg-1),二甲雙胍組與柔紅霉素聯(lián)合用藥組(100mg·kg-1+0.1mg·kg-1),以上各組裸鼠腹腔注射給藥,每只0.2mL,每隔3天給藥一次,給藥6次,處死裸鼠,檢測相應指標。(1)測量瘤體大小,繪制成瘤曲線;(2)稱量瘤體濕量,計算抑瘤率;(3)HE染色觀察瘤體轉(zhuǎn)移浸潤情況;(4)TUNEL檢測細胞凋亡情況;結(jié)果:(1)體外細胞實驗:(1)MTT法檢測顯示,不同濃度二甲雙胍(2.5、5、10、20、40、80mmol·L-1)、柔紅霉素(0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8?mol·L-1)作用于SW480細胞24h、48h、72h后均可降低細胞的存活率。兩者合用時,對細胞的生長抑制率明顯增加,且抑制作用具有濃度、時間依賴性。20mmol·L-1二甲雙胍作用于細胞24h、48h、72h后的存活率分別為66.35%、50.37%、42.02%。0.2?mol·L-1柔紅霉素作用于細胞24h、48h、72h后的存活率分別為63.12%、48.13%、45.24%。二甲雙胍與柔紅霉素(0.2 mol·L-1)合用作用于細胞24h、48h、72h的存活率分別為60.63%、45.29%、32.16%。明顯低于各單用組(P0.05)。(2)集落克隆結(jié)果顯示,在經(jīng)過結(jié)晶紫染色以后,克隆處顯示為紫色斑點,而細胞經(jīng)二甲雙胍和柔紅霉素單獨用藥及聯(lián)合用藥組處理后,與空白組比較,集落克隆形成數(shù)量均有所減少,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),進一步觀察兩者合用后,聯(lián)合用藥組與柔紅霉素單用組比較,克隆形成的斑點減少更加明顯,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(3)PI單染及Annexin V/PI雙染經(jīng)流式細胞儀檢測顯示:SW480細胞的自發(fā)凋亡率極低,在用藥以后,二甲雙胍和柔紅霉素單獨作用于細胞后凋亡率增加,兩者合用作用于細胞后,細胞凋亡率明顯增加,與空白組比較差異均具有顯著性(P0.05),與柔紅霉素單用組相比,聯(lián)合用藥組細胞凋亡率明顯增加,差異均具有顯著性(P0.05)。(4)Western blot及RT-PCR結(jié)果顯示,Bcl-2蛋白及mRNA的表達,與空白組比較,各組表達量減少,差異具有顯著性(P0.05);與柔紅霉素單用組比較,聯(lián)合用藥組表達量明顯減少,差異具有顯著性(P0.05);Bax蛋白及mRNA的表達,與空白組比較,其他各組表達量均增加,差異具有顯著性(P0.05);與柔紅霉素單用組比較,聯(lián)合用藥組表達量明顯增加,差異具有顯著性(P0.05);(2)動物實驗:(1)聯(lián)合用藥組的瘤體積、生長與單用組比,生長緩慢,體積縮小,差異具有顯著性(P0.05)。瘤體濕重及計算抑瘤率。結(jié)果顯示,與模型組相比,柔紅霉素組與聯(lián)合用藥組瘤重有明顯減少,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),與柔紅霉素組相比,聯(lián)合用藥組瘤重減少的更明顯,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(2)HE染色,在血管最豐富處即腫瘤的最外層,聯(lián)合用藥組同其他組相比,細胞正常區(qū)域較少,而壞死區(qū)域較多。(3)TUNEL檢測凋亡細胞,鏡下顯示聯(lián)合用藥組細胞凋亡最為明顯。結(jié)論:(1)二甲雙胍聯(lián)合柔紅霉素對人結(jié)腸癌SW480細胞增殖有抑制作用并能促進細胞凋亡,其作用機制可能與促進Bax蛋白表達,抑制Bcl-2蛋白表達有關。(2)二甲雙胍聯(lián)合柔紅霉素對SW480結(jié)腸癌荷瘤裸鼠有抗腫瘤增長作用,其機制可能與促進凋亡有關。
【圖文】：

圖 2-1 藥物對細胞增殖抑制作用( x ±s，n=5)A.二甲雙胍 B.柔紅霉素 C.二甲雙胍聯(lián)合柔紅霉素Fig.2-1 The effect of drugs on cell proliferation( x ±s，n=5A.Metformin B. Erythromycin C. Metformin and Erythromy腸癌細胞 SW480 集落克隆形成的抑制作用多的了解二甲雙胍和柔紅霉素單獨使用或者是聯(lián)合用80）在增殖方面的影響，在實驗中，我們根據(jù) MTT 實細胞，運用集落克隆形成實驗的檢測方法，，進一步觀察80）增殖抑制作用的影響。由結(jié)果，我們可以看出，在處顯示為紫色斑點，而細胞經(jīng)二甲雙胍和柔紅霉素單后，與空白組比較，集落克隆形成數(shù)量均有所減少，差進一步觀察兩者合用后，聯(lián)合用藥組與柔紅霉素單用

-2.藥物對結(jié)腸癌細胞SW480集落克隆形成的影響
【學位授予單位】：貴州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R96

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本文編號：2583414