【摘要】：目的:分別采用腫瘤細胞系和轉化細胞系摸索軟瓊脂克隆形成實驗的適宜條件,并對冬凌草甲素(oridonin,ORI)的抑瘤性和沒食子酸乙酯(ethyl gallate,EG)促瘤性進行評價。方法:1)摸索實驗條件:采用6孔板固態(tài)培養(yǎng)法,按不同密度(每孔500~20 000個)將腫瘤細胞系(Hela,K562和Hep G2)和轉化細胞系(Bhas 42)與軟瓊脂混合鋪板,計數克隆形成率。2)Hep G2細胞分別與質量濃度為0.016、0.08、0.4、2、10、50μg·mL~(-1)的ORI溶液混合后鋪板;Bhas 42細胞預先經質量濃度為0.3、1、3μg·mL~(-1)的EG溶液處理后,鏡下觀察細胞達到轉化狀態(tài)后,與軟瓊脂混合鋪板培養(yǎng)。經培養(yǎng)后觀察給藥處理對克隆形成率的影響。3)利用流式細胞儀分析ORI和EG對細胞周期的影響。結果:細胞接種密度為每孔1 000個左右時,利用腫瘤細胞和轉化細胞開展軟瓊脂克隆形成實驗效果較好。ORI作為抑瘤藥物在低濃度條件可顯著降低Hep G2細胞的克隆形成率(P0.01),且對細胞增殖有抑制作用。EG隨給藥濃度增加可顯著升高Bhas 42的克隆形成率(P0.01),但對細胞增殖影響不顯著。結論:軟瓊脂克隆形成實驗以克隆形成率為檢測指標,可較為簡便而靈敏地檢測藥物引起的抑瘤性和促瘤性。該實驗結果與細胞周期分析結果相互印證。兩者的有機結合,可用于藥物對細胞增殖及成瘤性的影響的初步分析。
【圖文】：

⌒緯陜?=平均每孔細胞克隆數/每孔中加入的細胞數×100%）。1.2.4細胞接種密度的選擇分別按每孔500、1000、2000、5000、10000、20000個的密度接種Hela、K562、HepG2及Bhas42細胞，其中Bhas42細胞分無處理組和PMA（50ng·mL-1）處理組，PMA采用0.1%DMSO現用現配，每組平行2孔。Bhas42細胞為可轉化細胞，PMA處理組和下述的EG給藥組細胞鋪板前使用的Bhas42細胞均預先經PMA給藥10d，此時鏡下可觀察到轉化灶的形成（圖1）。持續(xù)觀察克隆形成情況，鋪板、觀察、計數方法同上。A.未轉化（untransformed）B.轉化（transformed）圖1Bhas42細胞形態(tài)圖Fig.1RepresentativeimagesofBhas42cells（10×10）1.2.5藥物抑瘤性與成瘤性根據預實驗結果確定HepG2及Bhas42細胞接種密度為每孔1000個。HepG2細胞設空白對照組（ddH2O）、溶媒對照組（0.1%和1%DMSO）、ORI（0.016、0.08、0.4、2、10、50μg·mL-1）組；Bhas42細胞設空白對照組（ddH2O）、溶媒對照組（0.1%DMSO）、陽性對照組（PMA50、100ng·mL-1）、和EG（0.3、1、3μg·mL-1）組。ORI、PMA、EG溶液均采用0.1%DMSO配制，現用現配。制備上層瓊脂時將相應濃度的藥物、濃度為0.5×104個·mL-1的細胞液0.2mL、含20%FBS的2×細胞培養(yǎng)液2mL和0.7%瓊脂糖2mL混合均勻后鋪在底層瓊脂上，每孔2mL，每組平行2孔。持續(xù)觀察克隆形成情況，鋪板、觀察、計數方法

JournalofPharmaceuticalAnalysis藥物分析雜志Chinese·448·藥物分析雜志ChinJPharmAnal2017,37(3)圖2軟瓊脂克隆形成實驗細胞成瘤圖例Fig.2Representativeimageofsoftagarcolonyformationassay表3冬凌草甲素對HepG2細胞克隆形成的作用（n=2）Tab.3EffectsoforidonintotheclonyformationofHepG2cells處理條件（treatment）平均克隆數（averagedclonecount）/·cm-2克隆形成率（cloneformationrate）/%ddH2O85820.1%DMSO74711%DMSO109104ORI0.016μg·mL-14442**ORI0.08μg·mL-13433**ORI0.4μg·mL-13231**ORI2μg·mL-11211**ORI10μg·mL-1109**ORI50μg·mL-144**與0.1%DMSO比較（comparedwith0.1%DMSO），**P<0.01表4冬凌草甲素對HepG2細胞周期的影響（n=3）Tab.4EffectsoforidonintothecellcycleofHepG2cells處理條件（treatment）G1期（phaseG1）/%S期（phaseS）/%ddH2O70.99±1.0727.20±1.960.1%DMSO72.82±3.1826.37±2.82ORI0.016μg·mL-172.85±2.1024.21±1.94ORI0.08μg·mL-186.94±0.0413.06±0.04**ORI0.4μg·mL-186.78±2.1913.22±2.19**ORI2μg·mL-183.68±2.2716.32±2.28**ORI10μg·mL-190.04±2.349.30±2.77**與0.1%DMSO比較（comparedwith0.1%DMSO），，**P<0.01

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