【摘要】：熱驚厥(Febrile seizures, FS)是由高熱引起的驚厥發(fā)作,高發(fā)于6個(gè)月到5歲的嬰幼兒,是嬰幼兒時(shí)期常見的驚厥發(fā)作類型。熱驚厥的發(fā)作比例為3-14%,約有70%的驚厥發(fā)作為單次短時(shí)程發(fā)作(發(fā)作時(shí)間少于15分鐘),但是由于治療手段缺乏或治療不及時(shí),約30%的熱驚厥患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā),成為復(fù)雜性熱驚厥。大量研究發(fā)現(xiàn),復(fù)雜性熱驚厥會(huì)在很大程度上增加罹患成年癲癇、海馬硬化和認(rèn)知障礙的風(fēng)險(xiǎn)。目前臨床上主要利用地西泮或傳統(tǒng)的抗癲癇藥物如苯巴比妥、苯妥英等治療小兒熱驚厥,但它們只能控制驚厥發(fā)作癥狀而不能預(yù)防熱驚厥的發(fā)生,更不能控制反復(fù)發(fā)作,且對(duì)嬰幼兒具有明顯的毒副作用。而傳統(tǒng)的解熱鎮(zhèn)痛藥,如布洛芬等,只能緩解發(fā)熱癥狀,而不能控制驚厥發(fā)作。因此,探討FS的發(fā)生機(jī)制以及尋找更為有效的藥物治療潛在靶點(diǎn)已成為亟待解決的問題。有研究報(bào)道周期性發(fā)熱綜合征(Periodic Fever Syndrome, PFS)患者的血液中Caspase-1的表達(dá)水平顯著上調(diào)。Caspase-1是Caspases家族中調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的催化酶,其以無活性的前體形式(pro-Caspase-1)存在于細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞受到如高溫、ATP積累或鉀離子外流等外界刺激時(shí),pro-Caspase-1會(huì)與模式識(shí)別受體(Pattern Recognition Receptors, PRRs)、含有蛋白酶招募節(jié)段(Caspase Recruitment Domain, CARD)的結(jié)合分子(Associated Speck-like Protein Containing CARD, ASC)組裝成完整的炎癥小體,pro-Caspase-1自我催化形成有活性的催化酶(即激活形式,cleaved-Caspase-1)。cleaved-Caspase-1可剪切炎癥因子IL-1β和IL-18的前體,形成成熟的IL-1β和IL-18并分泌至胞外參與一系列炎癥反應(yīng)。在癲癇患者和顳葉癲癇的動(dòng)物模型上均檢測(cè)到cleaved-Caspase-1表達(dá)水平的顯著性上調(diào)。最新研究發(fā)現(xiàn),Caspase-1與神經(jīng)元興奮性密切相關(guān),在海馬的錐體神經(jīng)元和中間神經(jīng)元上均檢測(cè)到Caspase-1的表達(dá),給予AMPA受體激動(dòng)劑可以激活Caspase-1。由此,我們提出假設(shè)：Caspase-1作為熱敏感的炎癥因子,可能在熱驚厥發(fā)生過程中起到關(guān)鍵作用。因此,本課題采用不同溫度誘導(dǎo)驚厥發(fā)作,探討Caspase-1對(duì)熱驚厥發(fā)生的作用,并進(jìn)一步設(shè)計(jì)和篩選以Caspase-1為靶點(diǎn)的新型小分子抑制劑。將出生后8-10天(P8-10)的C57BL/6J小鼠放入溫度為38℃,41℃或44℃的烘箱中誘導(dǎo)驚厥發(fā)作,觀察驚厥發(fā)作癥狀并同步記錄腦電(Electroencephalogram, EEG)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,幼年小鼠在41℃和44℃環(huán)境中有驚厥發(fā)作,并伴隨有典型的癲癇樣EEG,而在38℃中沒有驚厥發(fā)作,也沒有癲癇樣EEG。同時(shí)發(fā)現(xiàn),在41℃和44℃中,幼年小鼠海馬組織內(nèi)cleaved-Caspase-1的表達(dá)水平在熱驚厥發(fā)作前顯著性上調(diào),同時(shí)Caspase-1的酶活性顯著性升高。而在38℃中,幼年小鼠海馬組織內(nèi)的cleaved-Caspase-1的表達(dá)水平和Caspase-1的酶活性均無明顯變化。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),Caspase-1敲除小鼠(Casp1-/-)對(duì)熱驚厥的發(fā)生有更低的易感性。與野生型(Wild Type,WT)小鼠相比,Casp1-/-小鼠的驚厥發(fā)作潛時(shí)延長,閾值抬高,發(fā)作比例降低。此外,在WT和Casp1-/-小鼠的海馬內(nèi)給予外源性Caspase-1或Caspase-1過表達(dá)的處理,幼年小鼠更易出現(xiàn)驚厥發(fā)作,表現(xiàn)為熱驚厥發(fā)作潛時(shí)縮短,發(fā)作閾值降低。同時(shí),過表達(dá)Caspase-1能夠提高神經(jīng)元興奮性,反之,Casp1-/-小鼠神經(jīng)元的興奮性降低。以上結(jié)果表明,Caspase-1在熱驚厥發(fā)生過程中發(fā)揮重要的作用�；贑aspase-1的結(jié)構(gòu)和催化位點(diǎn)(Cys285為酶催化位點(diǎn),Arg179,Arg341,Arg383, Gln283和Gly238為選擇性的天冬氨酸識(shí)別位點(diǎn)),我們通過分子對(duì)接(Glide module in Schrodinger)的計(jì)算機(jī)模擬方法設(shè)計(jì)了一系列新型小分子抑制劑。結(jié)合計(jì)算機(jī)虛擬篩選和Glide HTVS、SP、XP分子對(duì)接方法,我們篩選出144個(gè)化合物并對(duì)它們重新進(jìn)行排序,排名前50的化合物進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)價(jià)和篩選。通過分子實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的篩選,我們發(fā)現(xiàn)有4個(gè)化合物(編碼為6626080,6810755,9198978和7135306)對(duì)Caspase-1的酶活性具有顯著的抑制作用。結(jié)合化合物的構(gòu)效、結(jié)合能的能量和脂溶性分析,我們發(fā)現(xiàn)其中6626080不僅能夠透過血腦屏障,抑制驚厥發(fā)作,降低驚厥的發(fā)作比例,而且沒有明顯的毒副作用。同時(shí),電生理結(jié)果顯示,海馬腦片上給予6626080處理,其神經(jīng)元興奮性明顯降低。進(jìn)一步,我們發(fā)現(xiàn)6626080能夠抑制驚厥的反復(fù)發(fā)作。此外,將6626080包裹到只有在高溫(39℃C)中才會(huì)釋放的溫敏膠束中,給予幼年動(dòng)物預(yù)給藥的處理,可以預(yù)防熱驚厥的發(fā)作�？傊�,本課題發(fā)現(xiàn)高熱引起cleaved-Caspase-1的表達(dá)水平上調(diào),Caspase-1通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性,參與了熱驚厥的發(fā)病機(jī)制。此外,新型的Caspase-1選擇性抑制劑6626080,對(duì)熱驚厥的發(fā)生具有保護(hù)作用,其可能是預(yù)防和治療熱驚厥的新的治療策略。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R96

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本文編號(hào)：2563553