發(fā)布時間：2019-11-12 08:24

【摘要】：目的：近期我們研究發(fā)現(xiàn)既往主要應(yīng)用于治療感染中毒性休克、急性肺損傷等感染性炎性疾病的藥物烏司他丁在卵清蛋白（OVA）誘導(dǎo)的小鼠變應(yīng)性炎癥模型中具有免疫調(diào)節(jié)和抗氧化作用，同時還發(fā)現(xiàn)其免疫調(diào)節(jié)、抗氧化作用與血紅素加氧酶(Heme Oxygenase，HO)-1密切相關(guān)。 烏司他丁(Ulinastatin，UTI）是一種高效廣譜的水解酶抑制劑，感染性炎癥以中性粒細(xì)胞介導(dǎo)為主，而變應(yīng)性炎癥以嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等免疫細(xì)胞介導(dǎo)為主，二者的作用機制截然不同。因此進一步深入明確UTI在變應(yīng)性炎癥中的藥理作用機制，為其轉(zhuǎn)化為治療變應(yīng)性炎癥的輔助用藥提供實驗室依據(jù)。HO-1屬于微粒體催化酶，是體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)和抗氧化的重要調(diào)控因子。前期實驗我們發(fā)現(xiàn)，烏司他丁在體內(nèi)實驗?zāi)Ｐ椭邪l(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗氧化作用與HO-1密切相關(guān)，烏司他丁是否是通過調(diào)控HO-1以及是通過何種信號通路來調(diào)控HO-1發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗氧化作用的機制需要在體外細(xì)胞實驗?zāi)Ｐ椭羞M一步探討。 肥大細(xì)胞是介導(dǎo)變應(yīng)性炎癥的免疫細(xì)胞之一，變應(yīng)性炎癥的病理變化主要表現(xiàn)為肥大細(xì)胞活化脫顆粒，進而釋放大量炎性介質(zhì)。許多研究證明Th1/Th2細(xì)胞因子失衡是氣道變態(tài)反應(yīng)性炎癥疾病發(fā)病機制的主要原因之一。因此實驗選取Th2的代表因子IL-4作為刺激因素，它可以刺激B細(xì)胞增殖，從而產(chǎn)生大量的IgE抗體，導(dǎo)致肥大細(xì)胞活化。因此，本課題選用IL-4刺激肥大細(xì)胞活化，建立體外細(xì)胞實驗?zāi)Ｐ蛯跛舅“l(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗氧化的藥理作用機制進行深入探討。 方法：肥大細(xì)胞（P815細(xì)胞株，購買自美國）培養(yǎng)于1640培養(yǎng)基中，其中含有10%新生牛血清,根據(jù)實驗設(shè)計分組：空白對照組（Con組）、IL-4刺激組、烏司他丁干預(yù)組（UTI+IL-4組）、Znpp干預(yù)組（Znpp+UTI+IL-4組）。通過檢測類胰蛋白酶活力及Th1/Th2細(xì)胞因子（IL-5、IL-13、TNF-α、INF-γ）水平從免疫調(diào)節(jié)角度驗證烏司他丁是否能夠抑制IL-4介導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化；通過檢測活性自由氧（ROS）、蛋白質(zhì)羥基含量水平、丙二醛（MDA）及抗氧化酶指標(biāo)：總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、微量還原性谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的水平從氧化應(yīng)激角度驗證烏司他丁是否能夠調(diào)節(jié)IL-4介導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化引起的氧化/抗氧化失衡；應(yīng)用血紅素加氧酶(Heme Oxygenase，HO)-1的抑制劑Znpp驗證烏司他丁是否通過調(diào)節(jié)HO-1來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗氧化作用；通過電泳遷移率（EMSA）、WesternBlot等方法檢測HO-1的上游調(diào)控因子Nrf2及相關(guān)信號通路探討烏司他丁調(diào)節(jié)HO-1表達(dá)的具體機制。 結(jié)果： 1IL-4、UTI的最適干預(yù)時間和濃度 通過MTT法及類胰蛋白酶活力實驗確定IL-4的最適宜濃度及干預(yù)時間分別為100ng/ml、6h；通過MTT法及UTI誘導(dǎo)HO-1蛋白水平的表達(dá)確定UTI的最適宜濃度及干預(yù)時間分別為100U/ml、2h。 2Znpp抑制HO-1在肥大細(xì)胞中的表達(dá) 肥大細(xì)胞在給予HO-1的抑制劑Znpp干預(yù)后，HO-1的表達(dá)無論是在細(xì)胞免疫熒光水平，還是在蛋白表達(dá)水平都有明顯減弱趨勢，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P㩳0.05）。 3UTI抑制IL-4介導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒 IL-4刺激肥大細(xì)胞后，類胰蛋白酶活力明顯增強，高于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P㩳0.05）；UTI能夠明顯降低類胰蛋白酶活力，抑制肥大細(xì)胞活化狀態(tài)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P㩳0.05）。 4UTI調(diào)節(jié)IL-4介導(dǎo)肥大細(xì)胞活化引起的Th1/Th2細(xì)胞因子失衡 Th1代表因子IL-5、IL-13、TNF-α的表達(dá)在IL-4刺激組明顯高于空白對照組，Th2代表因子INF-γ的表達(dá)明顯低于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P㩳0.05）；UTI明顯抑制IL-5、IL-13、TNF-α的表達(dá)，提高INF-γ的表達(dá)，，從而調(diào)節(jié)IL-4介導(dǎo)肥大細(xì)胞活化引起的Th1/Th2細(xì)胞因子失衡，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P㩳0.05）。 5UTI調(diào)節(jié)IL-4介導(dǎo)肥大細(xì)胞活化引起的氧化/抗氧化失衡 在空白對照組中，活性自由氧（ROS）、蛋白質(zhì)羥基含量及丙二醛(MDA)處于低水平；給予IL-4刺激后，三個氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P㩳0.05），抗氧化酶（T-AOC、SOD、CAT、GSH、GSH-Px）水平明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P㩳0.05）；當(dāng)給予UTI干預(yù)后，ROS、蛋白質(zhì)羥基含量及MDA水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P㩳0.05），抗氧化酶（T-AOC、SOD、CAT、GSH、GSH-Px）水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P㩳0.05）。 6UTI誘導(dǎo)HO-1蛋白水平的表達(dá)，呈現(xiàn)時間及劑量依賴性 在一定時間或濃度范圍內(nèi)，隨著UTI干預(yù)時間的延長或濃度的增加，HO-1蛋白水平表達(dá)呈現(xiàn)明顯增加趨勢，存在時間及劑量依賴關(guān)系，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P㩳0.05）。 7UTI誘導(dǎo)Nrf2核轉(zhuǎn)移 隨著UTI干預(yù)時間的延長，Nrf2在胞漿中的表達(dá)逐漸降低，在胞核中的表達(dá)逐漸增強，存在Nrf2從胞漿向胞核轉(zhuǎn)移的趨勢，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P㩳0.05）。 8UTI增強Nrf2與ARE的結(jié)合活性 電泳遷移率檢測（EMSA）實驗結(jié)果顯示：隨著UTI干預(yù)時間的延長，Nrf2與ARE結(jié)合活性明顯增強。 9UTI激活P38MAPK/Nrf2信號通路調(diào)節(jié)HO-1表達(dá) Western Blot結(jié)果顯示：隨著UTI干預(yù)時間的延長，UTI能夠增強磷酸化的P38蛋白表達(dá)水平，而磷酸化的JNK、ERK蛋白表達(dá)水平均無明顯差異性；當(dāng)實驗中分別加入P38的抑制劑（SB203580），JNK的抑制劑(SP600125)以及ERK的抑制劑（PD98059）后，HO-1表達(dá)能被P38的抑制劑（SB203580）所抑制，而JNK及ERK的抑制劑對HO-1表達(dá)均無明顯作用，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P㩳0.05）。 結(jié)論： 1烏司他丁在IL-4介導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化中具有顯著的免疫調(diào)節(jié)、抗氧化作用。 2烏司他丁通過誘導(dǎo)HO-1表達(dá)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗氧化作用。 3烏司他丁通過P38MAPK/Nrf2信號通路實現(xiàn)了對HO-1表達(dá)的調(diào)控。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R96

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前8條

1 路新卿;劉志軍;李桂英;李校天;姜慧卿;;血紅素加氧酶-1在門靜脈高壓性胃病大鼠中的表達(dá)及意義[J];河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2012年08期

2 趙卉;井軍虎;李建強;劉卓拉;;膽紅素在大鼠肺臟缺血再灌注損傷中的抗凋亡作用[J];中國藥物與臨床;2007年09期

3 李慧;陳麗;;血紅素加氧酶-1與糖尿病心肌病變[J];國際內(nèi)科學(xué)雜志;2007年06期

4 袁紅;鄭靜晨;劉平;張韶峰;許建陽;白麗敏;;帕金森病的發(fā)病機理:氧化應(yīng)激,環(huán)境影響因素與神經(jīng)炎癥(英文)[J];Neuroscience Bulletin;2007年02期

5 任文霞;弓清梅;趙鷹;李建強;劉卓拉;;膽紅素對大鼠急性肺損傷形成過程中氧自由基以及caspase-3表達(dá)的影響[J];中國病理生理雜志;2007年02期

6 劉少華;馬可;許兵;徐鑫榮;;一氧化碳吸入對脂多糖誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷的保護作用(英文)[J];生理學(xué)報;2006年05期

7 李建強,高曉玲,劉卓拉,徐永健,張珍祥;膽紅素對急性肺損傷大鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞核因子κB,細(xì)胞間粘附分子1表達(dá)的影響[J];中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志;2004年01期

8 李玉明,劉俊昌,張敏,鄭新程,吳立玲,時安云,伍貽經(jīng);內(nèi)毒素引起的乳鼠心肌細(xì)胞血紅素加氧酶-1基因的表達(dá)[J];生理學(xué)報;2001年01期

本文編號：2559690