發(fā)布時間：2019-10-24 07:29

【摘要】：與其受體有關。方法：采用酒精灌胃配合高脂飲食,制備大鼠脂肪肝模型,造模的同時灌胃褪黑素預防給藥。6周末取血,分離血清,試劑盒檢測谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST),谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT),甘油三酯(TG),低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C);肝勻漿檢測肝臟SOD活性和MDA、TG水平；制備石蠟切片進行組織病理學的檢查；Western blot檢測大鼠肝臟AMPK-α及磷酸化AMPK-α的表達。同時采用酒精聯(lián)合油酸刺激HepG2細胞建立體外肝細胞脂質(zhì)蓄積模型,油紅O(ORO)染色對體外模型進行評價；試劑盒檢測細胞內(nèi)TG和cAMP水平；Westernblot檢測大鼠肝臟AMPK-α,磷酸化AMPK-α及褪黑素受體1(MT1R)的蛋白的表達。結(jié)果：1.褪黑素對大鼠AFL的保護作用本研究采用酒精聯(lián)合高脂飲食造模,造模的同時灌胃給予褪黑素(10、20、40 mg/kg),陽性藥組給予還原型谷胱甘肽(GSH,180 mg/kg),腹腔注射給藥,共給藥6周。病理學檢查結(jié)果顯示,褪黑素和GSH給藥均可顯著改善肝臟的脂肪變性程度。與正常組相比,模型組大鼠體重明顯下降,褪黑素用藥后無明顯改變,但褪黑素低、中、高劑量組均可不同程度的降低大鼠肝臟指數(shù)。生物學指標檢測表明,褪黑素可顯著降低血清ALT、AST的水平。以上結(jié)果提示,褪黑素對AFL大鼠有明顯的防治作用。2.褪黑素對AFL大鼠脂質(zhì)代謝的影響與正常組相比,酒精和高脂飲食聯(lián)合刺激導致大鼠血清TG、LDL-C和肝臟TG的水平顯著上升,血清HLD-C的水平顯著下降。褪黑素20mg/kg或40 mg/kg劑量給藥后可顯著降低血清TG、LDL-C和肝臟TG的水平,升高血清HLD-C的水平。提示褪黑素對大鼠AFL的肝臟保護作用可能與其調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝,減輕脂質(zhì)沉積有關。3.褪黑素對AFL大鼠肝臟氧化代謝的影響與正常組相比,模型組大鼠肝勻漿中SOD的活性顯著下降,脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的水平顯著增加。表明,酒精和高脂飲食聯(lián)合刺激導致模型組大鼠體內(nèi)氧化和抗氧化失衡,活性氧(ROS)及自由基產(chǎn)生增加,啟動脂質(zhì)過氧化反應。褪黑素給藥后,肝臟SOD的活性顯著增加,MDA的水平顯著下降。提示,褪黑素對大鼠AFL的保護作用可能與其抗氧化應激和減輕脂質(zhì)過氧化作用有關。4.褪黑素對AFL大鼠肝臟AMPK蛋白表達的影響腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase, AMPK)是一類能被AMP激活的蛋白激酶,在脂肪代謝的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用。與正常組相比,模型大鼠肝臟磷酸化的AMPK-α水平顯著降低,褪黑素給藥后磷酸化AMPK-α蛋白的表達增加。AMPK-α的磷酸化形式為其活化形式,即褪黑素用藥后增加肝臟AMPK-α的活性。以上結(jié)果提示,褪黑素調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用可能與增強AMPK-α的活性有關。5.褪黑素對酒精聯(lián)合油酸刺激的HepG2細胞脂質(zhì)代謝的影響為進一步探討褪黑素如何調(diào)節(jié)AMPK-α活性,我們采用酒精聯(lián)合油酸刺激HepG2細胞建立了體外肝細胞脂肪蓄積模型。油紅染色結(jié)果顯示,正常組細胞呈鋪路石樣排列,細胞內(nèi)少見紅色脂滴,酒精聯(lián)合油酸刺激組(O+A組)細胞內(nèi)紅色脂滴較多,部分細胞的脂滴圍繞細胞膜內(nèi)側(cè)呈環(huán)狀排列,褪黑素用藥后脂滴減少。同時油紅染色的定量結(jié)果也同樣顯示,褪黑素10-8、10-7、10-6、10-5M劑量組均可不同程度降低細胞內(nèi)的脂滴。TG的測定結(jié)果顯示,與正常組相比,O+A組細胞內(nèi)TG的含量顯著增加,褪黑素10-8、10-7、10-6、10-5 M劑量均可不同程度降低細胞內(nèi)TG的含量。以上結(jié)果表明,我們用乙醇和油酸聯(lián)合刺激成功的構(gòu)建了體外肝臟脂肪蓄積模型,而褪黑素對酒精聯(lián)合油酸刺激的體外肝細胞脂肪蓄積具有減輕作用。6.褪黑素對酒精聯(lián)合油酸刺激的HepG2細胞內(nèi)AMPK的影響與正常組相比,油酸+乙醇(O+A)組磷酸化AMPK-α的表達顯著降低,褪黑素用藥后磷酸化AMPK-α水平顯著增加,而同時給予褪黑素的同時給予褪黑素受體競爭性拮抗劑Luzindole組磷酸化AMPK-α的蛋白水平與褪黑素單獨用藥組相比顯著降低。提示褪黑素對HepG2細胞內(nèi)AMPK-α的活性調(diào)節(jié)作用可能是由其受體介導的。7.褪黑素對酒精聯(lián)合油酸刺激的HepG2細胞內(nèi)MTlR/cAMP的影響與正常組相比,O+A組MT1R的蛋白表達顯著降低,褪黑素及褪黑素加Luzindole顯著增加了MT1R的蛋白表達。cAMP的檢測結(jié)果顯示,乙醇和油酸聯(lián)合刺激使HepG2細胞內(nèi)cAMP水平顯著增加,褪黑素10-7、10-6、10-5 M給藥均可顯著降低HepG2細胞內(nèi)cAMP的水平,同時在褪黑素10-6給藥基礎上給予Luzindole可逆轉(zhuǎn)褪黑素的降低HepG2細胞內(nèi)cAMP的水平的作用。結(jié)果提示,褪黑素對HepG2細胞內(nèi)AMPK-α的活性調(diào)節(jié)作用可能與其對MT1R/cAMP信號通路的調(diào)節(jié)作用有關。結(jié)論：1.褪黑素能夠從病理上改善大鼠肝臟脂質(zhì)蓄積,并能降低血清ALT、AST、TG、 LDL-C和肝臟TG、MDA的水平,增加血清HLD-C水平和肝臟SOD的活性,對大鼠AFL具有保護作用。2.褪黑素可增加AFL大鼠肝臟和酒精和油酸聯(lián)合誘導的HepG2細胞磷酸化AMPK-α的蛋白表達,并發(fā)現(xiàn)褪黑素對HepG2細胞內(nèi)AMPK-α的活性調(diào)節(jié)作用可能與其對MT1R/cAMP信號通路的調(diào)節(jié)作用有關。
【圖文】：

３．６，

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