發(fā)布時間：2019-10-13 01:12

【摘要】：目的：以人髓性白血病HL-60細(xì)胞為研究對象,探討三氧化二砷誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞自噬的作用機(jī)制,闡明其作用分子機(jī)理。方法：以人源HL-60、293T、NB4細(xì)胞為研究對象,利用不同濃度的砷劑(iAsⅢ)作用細(xì)胞后,通過Western-blot法檢測其自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。其次,主要以HL-60細(xì)胞為研究對象,檢測砷劑暴露后細(xì)胞內(nèi)ATP變化和線粒體膜電位變化(用JC-1熒光染色)；同時,運用丙酮酸脫氫酶、乳酸、丙酮酸三種檢測試劑,分別檢測砷劑作用HL-60細(xì)胞后,其細(xì)胞內(nèi)丙酮酸脫氫酶復(fù)合物活性和乳酸及丙酮酸的含量變化。最后,研究外源性的丙酮酸和乳酸對HL-60細(xì)胞誘導(dǎo)自噬影響,以Western-blot法檢測其自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)變化。結(jié)果：砷劑處理人源HL-60、293T、NB4三種細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)iAsⅢ引起不同細(xì)胞株的自噬發(fā)生。尤其,我們發(fā)現(xiàn)砷劑處理HL-60細(xì)胞6h后,砷劑對細(xì)胞能量代謝(ATP)沒有明顯抑制作用。用JC-1熒光染色測定線粒體膜電位變化,結(jié)果顯示iAsⅢ(1、2μM)處理HL-60細(xì)胞后線粒體膜電位下降不明顯,只有iAsⅢ(5μM)時略有下降。其次,利用不同濃度的iAsⅢ(1、2和5μM)作用HL-60細(xì)胞6小時后,探討了丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDHc-LA)表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)隨著暴露濃度增加PDHc-LA的表達(dá)量顯著下降。另外,我們進(jìn)一步探討了砷劑(2μM)作用HL-60細(xì)胞后對PDHc-LA的時效影響變化,觀測到PDHc-LA的表達(dá)量隨時間顯著下降。同時,我們研究了砷劑對HL-60細(xì)胞的丙酮酸脫氫酶活性的影響,發(fā)現(xiàn)砷劑對丙酮酸脫氫酶復(fù)合物有顯著抑制作用,而且我們還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)丙酮酸和乳酸含量顯著升高。最后,探討了外源性的乳酸和丙酮酸誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞自噬影響,結(jié)果顯示外源性的乳酸能夠誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞自噬發(fā)生(LC3-Ⅱ顯著上調(diào))。結(jié)論：本課題擬在前期研究基礎(chǔ)上對三氧化二砷通過抑制丙酮酸脫氫酶活性誘導(dǎo)細(xì)胞自噬進(jìn)行更深入的研究和探討。顯示iAsⅢ可以誘導(dǎo)多種白血病細(xì)胞發(fā)生自噬。iAsⅢ能夠抑制丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的活性,但其產(chǎn)生的ATP未發(fā)生明顯變化。iAsⅢ作用于HL-60細(xì)胞后,丙酮酸和乳酸含量升高。然而外源性乳酸(而不是丙酮酸)能夠誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞發(fā)生自噬,暗示iAsⅢ可能是介導(dǎo)乳酸來誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞發(fā)生自噬。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R96

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本文編號：2548382