【摘要】：胰腺癌是惡性程度極高的腫瘤,由于早期難于診斷,局部侵襲力高、早期易轉(zhuǎn)移以及對(duì)化療產(chǎn)生抵抗的特點(diǎn),導(dǎo)致胰腺癌病人的預(yù)后非常差。手術(shù)治療的復(fù)發(fā)率達(dá)20-25%,術(shù)后主要采用化療藥物吉西他濱或／和5-Fu治療。但是由于化療藥物毒性及耐藥等缺點(diǎn),導(dǎo)致胰腺癌患者的治療效果不佳,5年生存率仍小于5%。由于胰腺癌的發(fā)生是一個(gè)多基因異常引起的復(fù)雜病理過(guò)程。因此,干預(yù)多條信號(hào)通路的新靶點(diǎn)藥物可能具有更大的治療前景。熱休克蛋白90(HSP90)作為重要的分子伴侶,能夠輔助蛋白折疊、裝配和成熟,維持多種信號(hào)傳導(dǎo)蛋白的穩(wěn)定,從而保持細(xì)胞生長(zhǎng)和存活。大多數(shù)已鑒定的HSP90的客戶(hù)蛋白是癌蛋白。如：跨膜的酪氨酸激酶(HER-2、EGFR、IGFR),信號(hào)蛋白(AKT、c-RAF、P53、 V-src)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)者(CDK4、CDK6)和轉(zhuǎn)錄因子(STAT3和HIF-la)等,這些癌蛋白直接參與胰腺癌的生長(zhǎng)和血管生成。HSP90在包括胰腺癌在內(nèi)的許多腫瘤細(xì)胞中高表達(dá),可達(dá)正常細(xì)胞的2-10倍,可使腫瘤中過(guò)度激活或突變的癌客戶(hù)蛋白保持活性和避免降解,從而加速腫瘤增殖和惡性轉(zhuǎn)變。阻斷HSP90的分子伴侶功能,能夠使許多癌蛋白同時(shí)失去穩(wěn)定性并降解失活,達(dá)到“一靶多效”的抗癌效果。而且腫瘤細(xì)胞中具有特定的HSP90活性超伴侶復(fù)合體結(jié)構(gòu),使HSP90抑制劑的親和力比對(duì)正常細(xì)胞高出100倍,這使得HSP90成為備受關(guān)注的抗腫瘤新靶點(diǎn)。HSP90是同源二聚體,每個(gè)單體包括三個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域：N端與ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域(P1-E245)、中間結(jié)構(gòu)域(K246-D528)和C端二聚化結(jié)構(gòu)域(G529-D723)。ATP與HSP90 N末端結(jié)合以及ATP被HSP90 ATPase水解驅(qū)動(dòng)HSP90構(gòu)象循環(huán),維持HSP90的活性。目前,大多數(shù)HSP90抑制劑是針對(duì)其N(xiāo)末端ATP結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì),其中一些已經(jīng)進(jìn)入臨床前或臨床抗腫瘤研究。格爾德霉素類(lèi)(GAs)是最早被發(fā)現(xiàn)的HSP90抑制劑,其中17-AAG是經(jīng)典的HSP90 N末端抑制劑,具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性(IC50N達(dá)10-8-9M)。然而GAs存在很多不足,如嚴(yán)重的肝臟毒性、依賴(lài)體內(nèi)醌還原酶NQO1P450 CYP3A4的代謝活化及易產(chǎn)生耐藥等,限制了其臨床應(yīng)用。隨著化學(xué)結(jié)構(gòu)和高通量篩選技術(shù)地迅猛發(fā)展,一些具有嘌呤骨架或間苯二酚結(jié)構(gòu)的HSP90抑制劑被開(kāi)發(fā),女PU3、CCT018159和VER-52296等。晶體衍射和構(gòu)效關(guān)系研究表明,具有間苯二酚異VA唑結(jié)構(gòu)的VER-52296可以嵌入HSP90ATP口袋,可顯著地降低癌蛋白c-RAF和HER-2等,從而發(fā)揮廣譜的抗腫瘤增殖作用。然而,研究顯示VER-52296對(duì)正常細(xì)胞具有同樣的活性。在期臨床研究中,一些注射VER-52296的實(shí)體瘤患者出現(xiàn)了惡心、嘔吐、夜盲等不良反應(yīng)。因此,這部分課題的研究目標(biāo)是建立篩選N末端HSP90抑制劑的熒光偏振體系；對(duì)80個(gè)具有全新結(jié)構(gòu)的間苯二酚衍生物進(jìn)行HSP90親和活性的篩選,并評(píng)價(jià)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用；對(duì)候選化合物Y306zh進(jìn)行體內(nèi)、外抗腫瘤藥效學(xué)評(píng)價(jià)；并闡明Y306zh抑制胰腺癌增殖的分子機(jī)制,為該類(lèi)化合物的后續(xù)研發(fā)奠定堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究工作由以下四部分內(nèi)容組成：1)誘導(dǎo)并純化人源重組HSP90a蛋白,建立用于HSP90抑制劑篩選的熒光偏振體系將pET24α(+)-HSP90a重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3),經(jīng)1mM IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá),采用Ni-NTA親和層析樹(shù)脂純化HSP90α蛋白。選用VER00051001為探針?lè)肿?檢測(cè)不同濃度HSP90α蛋白或探針?lè)肿訉?duì)熒光偏振值的影響,并采用HSP90抑制劑NVP-AUY922和GA驗(yàn)證熒光偏振體系是否建立成功。2)HSP90抑制劑的篩選隨機(jī)地選擇7種常用的人源性腫瘤細(xì)胞株,采用MTT法,對(duì)兩批送樣的具有間苯二酚三氮唑或異VA唑的80個(gè)化合物進(jìn)行細(xì)胞毒檢測(cè)。分別選取細(xì)胞毒活性較好的化合物,采用熒光偏振法對(duì)其與HSP90的親和力進(jìn)行初篩和復(fù)篩,得到候選化合物。其中,化合物Y306zh在酶學(xué)和細(xì)胞水平均顯示出較好的活性,為此對(duì)其進(jìn)行深入地抗腫瘤機(jī)制研究。3)候選化合物Y306zh的體內(nèi)、外抗胰腺癌增殖作用研究采用MTT法,檢測(cè)了Y306zh對(duì)15株人腫瘤細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用,篩選出Y306zh的敏感瘤株為胰腺癌。并檢測(cè)Y306zh對(duì)五株具有不同程度HSP90a表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Y306zh對(duì)胰腺癌細(xì)胞周期阻滯,及誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡的作用。在胰腺癌Mia-paca2細(xì)胞的裸鼠異體移植瘤實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)檢測(cè)荷瘤鼠體重、瘤體積和瘤重的變化,以及瘤組織中增殖指標(biāo)Ki-67的陽(yáng)性率,來(lái)評(píng)價(jià)Y306zh的體內(nèi)抗胰腺癌作用。4)Y306zh抑制胰腺癌增殖的分子機(jī)制研究采用熒光偏振技術(shù)檢測(cè)Y306zh與HSP90 N末端的親和力。采用ATP瓊脂糖小球結(jié)合實(shí)驗(yàn)和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)Y306zh對(duì)胰腺癌細(xì)胞內(nèi)ATP結(jié)合型的HSP90活性形式及HSP90與輔助分子伴侶p23、CDC37的相互作用。采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Y306zh對(duì)胰腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的兩個(gè)重要客戶(hù)蛋白EGFR和IGF-1Rβ的表達(dá),及其下游PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路中關(guān)鍵分子蛋白表達(dá)的影響。預(yù)先給予蛋白酶體抑制劑MGl32,檢測(cè)是否逆轉(zhuǎn)Y306zh對(duì)客戶(hù)蛋白EGFR、IGF-1Rβ、AKT、c-RAF和CDK4的降解作用。采用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Y306zh誘導(dǎo)客戶(hù)蛋白的泛素—蛋白酶體降解是否與HSP90-HSP70-CHIP-客戶(hù)蛋白復(fù)合體的形成相關(guān)。綜上所述,本課題取得的主要進(jìn)展如下：1)采用pET24a(+)-HSP90a原核表達(dá)系統(tǒng),成功地誘導(dǎo)表達(dá)并純化了具有活性的HSP90a蛋白,建立并優(yōu)化了用于HSP90抑制劑篩選的熒光偏振體系。2)從80個(gè)具有間苯二酚三氮唑或異VA唑結(jié)構(gòu)的化合物中篩選出24個(gè)化合物,它們對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的IC50值在10-6-10-7M。并且絕大多數(shù)化合物(～20個(gè))可與VER00051001競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合HSP90,IC50值在10-7-10"8M。3)Y306zh是一種全新結(jié)構(gòu)的有效的HSP90抑制劑,具有較好的體內(nèi)、外抗胰腺癌作用,并且具有較好的腫瘤選擇性和安全性。4)Y306zh可以通過(guò)抑制ATP與HSP90的結(jié)合,并阻礙p23與HSP90的相互作用,從而抑制HSP90的分子伴侶活性,導(dǎo)致胰腺癌中優(yōu)勢(shì)客戶(hù)蛋白IGF-1Rβ和EGFR去穩(wěn)定化,并抑制其介導(dǎo)的PI3K/AKT和MAPK兩大增殖／存活信號(hào)通路,發(fā)揮抗胰腺癌增殖作用。
【圖文】：

有助于ＡＴＰ依賴(lài)的諸如ｃｄｃ３７、ｐ２３和免疫親和素等其它輔助分子伴侶的相互逡逑作用，從而形成成熟的超伴侶復(fù)合體這種狀態(tài)下，ＨＳＰ９０才能發(fā)揮其分子伴逡逑侶功能，促進(jìn)其客戶(hù)蛋白的構(gòu)象成熟（如圖３所示）。在腫瘤細(xì)胞中ＨＳＰ９０逡逑處于成熟的超伴侶復(fù)合體的活化狀態(tài)，而在正常細(xì)胞中則主要處于未結(jié)合輔助分子逡逑伴侶的靜息狀態(tài)，使得ＨＳＰ９０抑制劑在腫瘤細(xì)胞中的親和力比對(duì)正常細(xì)胞高出１００逡逑倍。因此，ＨＳＰ９０可成為選擇性好的新型抗腫瘤藥物靴點(diǎn)。逡逑恣心逡逑^+’邋凝逡逑ＡＯ巳＇。邐ＩｎｔｏｎｎｅＡａｔｅ逡逑寺ｉ邐齡逡逑管邋１逡逑Ｌａｔｅ邋Ｃ＜？７＾）ｌｅｘ邐Ａｓｙｍｍｅｔｎｃ邋Ｃｏｒｒ＾ｅｘ逡逑Ｃｉｔｅｄ邋ｂｙ邋Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ邋ｅｔ邋Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ邋Ａｃｔａ邋館ＢＡ）邋－邋Ｍｏｌｅｃｉｄａｒ邋ＣｅＵ邋Ｒｅｓｅａｒｃｈ，邋２０１２．逡逑圖３邋ＨＳＰ９０加工客戶(hù)蛋白的構(gòu)象變化示意圖逡逑３、ＨＳＰ９０抑制劑逡逑ＨＳＰ９０抑制劑的出現(xiàn)為一系列實(shí)體瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療開(kāi)辟了新的途逡逑徑，正在被廣泛應(yīng)用于前列腺癌、乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、慢性髓細(xì)胞性白血病、逡逑１３逡逑

２．邋７．邋１確定反應(yīng)體系中各組分的用量逡逑（１）確定ＨＳＰ９０ａ的用量逡逑在反應(yīng)體系中給予足量的探針ＶＥＲ０００５１００１邋（終濃度８0１１＼１，５＾ｉＬ），設(shè)定不同逡逑的ＨＳＰ９０ａ蛋白濃度（０．０３３５、０．０６７、０．１００５、０．１３４、０．１６７５、０．２０１、０．３３５、０．５０３、逡逑０．６７０、０．８３８、１．００５、１．６乃帖／陣，每孔１陣），分別測(cè)定上述ＨＳＰ９０ａ蛋白濃度下的逡逑巧光偏振值（ＦＰ，，ｍＰ），根據(jù)反應(yīng)曲線(xiàn)確定最適酶量。逡逑（２）確定探針的用量逡逑在反應(yīng)體系中加入５呼終濃度為２．０１帖／ｍＬ的焌Ｐ９０ａ，在不同濃度的探針下（１０、逡逑２０、４０、６０、８０、１００、１６０ｎＭ），分別測(cè)定反應(yīng)體系的ＦＰ值，根據(jù)反應(yīng)曲線(xiàn)確定逡逑最適的探針用量。此外，根據(jù)公式計(jì)算已建立英光偏振體系的Ｚ’值和信噪比（Ｓ／Ｎ）。逡逑公式如下：逡逑Ｚ，＝�。撸ㄥ澹常铮猓椋睿洌椋睿纾常幔妫颍澹澹慑澹蓿椋猓椋睿洌椋睿纭蓿椋妫颍澹邋澹慑澹诲澹渝澹五澹藉澹ǎ椋猓椋睿洌椋睿纭�，ｆｒｅｅ）／ａｆｒｅｅ逡逑（訂為標(biāo)準(zhǔn)差，Ｈ為均值，ｂｉｎｄｉｎｇ；游離探針＋ＨＳＰ９０ａ，ｆｒｅｅ：游離探針）逡逑２．邋７．邋２巧光偏振法檢測(cè)ＧＡ、ＮＶＰ－ＡＵＹ９２２與ＨＳＰ９０ａ的親和活性逡逑，入濃的陽(yáng)（ＧＡ／ＮＶＰ－ＡＵＹ９２２），
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R96

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 ;Blockage of IGF-1R signaling sensitizes urinary bladder cancer cells to mitomycin-mediated cytotoxicity[J];Cell Research;2001年02期

2 ;Hsp90 inhibition results in autophagy-mediated proteasome-independent degradation of IκB kinase(IKK)[J];Cell Research;2006年11期

3 ;Down-regulation of p210~(bcr/abl)by curcumin involves disrupting molecular chaperone functions of Hsp90[J];Acta Pharmacologica Sinica;2006年06期

本文編號(hào)：2546342