【摘要】：胰腺癌是惡性程度極高的腫瘤,由于早期難于診斷,局部侵襲力高、早期易轉移以及對化療產生抵抗的特點,導致胰腺癌病人的預后非常差。手術治療的復發(fā)率達20-25%,術后主要采用化療藥物吉西他濱或／和5-Fu治療。但是由于化療藥物毒性及耐藥等缺點,導致胰腺癌患者的治療效果不佳,5年生存率仍小于5%。由于胰腺癌的發(fā)生是一個多基因異常引起的復雜病理過程。因此,干預多條信號通路的新靶點藥物可能具有更大的治療前景。熱休克蛋白90(HSP90)作為重要的分子伴侶,能夠輔助蛋白折疊、裝配和成熟,維持多種信號傳導蛋白的穩(wěn)定,從而保持細胞生長和存活。大多數已鑒定的HSP90的客戶蛋白是癌蛋白。如：跨膜的酪氨酸激酶(HER-2、EGFR、IGFR),信號蛋白(AKT、c-RAF、P53、 V-src)細胞周期調節(jié)者(CDK4、CDK6)和轉錄因子(STAT3和HIF-la)等,這些癌蛋白直接參與胰腺癌的生長和血管生成。HSP90在包括胰腺癌在內的許多腫瘤細胞中高表達,可達正常細胞的2-10倍,可使腫瘤中過度激活或突變的癌客戶蛋白保持活性和避免降解,從而加速腫瘤增殖和惡性轉變。阻斷HSP90的分子伴侶功能,能夠使許多癌蛋白同時失去穩(wěn)定性并降解失活,達到“一靶多效”的抗癌效果。而且腫瘤細胞中具有特定的HSP90活性超伴侶復合體結構,使HSP90抑制劑的親和力比對正常細胞高出100倍,這使得HSP90成為備受關注的抗腫瘤新靶點。HSP90是同源二聚體,每個單體包括三個高度保守的結構域：N端與ATP結合結構域(P1-E245)、中間結構域(K246-D528)和C端二聚化結構域(G529-D723)。ATP與HSP90 N末端結合以及ATP被HSP90 ATPase水解驅動HSP90構象循環(huán),維持HSP90的活性。目前,大多數HSP90抑制劑是針對其N末端ATP結構域設計,其中一些已經進入臨床前或臨床抗腫瘤研究。格爾德霉素類(GAs)是最早被發(fā)現(xiàn)的HSP90抑制劑,其中17-AAG是經典的HSP90 N末端抑制劑,具有很強的抗腫瘤活性(IC50N達10-8-9M)。然而GAs存在很多不足,如嚴重的肝臟毒性、依賴體內醌還原酶NQO1P450 CYP3A4的代謝活化及易產生耐藥等,限制了其臨床應用。隨著化學結構和高通量篩選技術地迅猛發(fā)展,一些具有嘌呤骨架或間苯二酚結構的HSP90抑制劑被開發(fā),女PU3、CCT018159和VER-52296等。晶體衍射和構效關系研究表明,具有間苯二酚異VA唑結構的VER-52296可以嵌入HSP90ATP口袋,可顯著地降低癌蛋白c-RAF和HER-2等,從而發(fā)揮廣譜的抗腫瘤增殖作用。然而,研究顯示VER-52296對正常細胞具有同樣的活性。在期臨床研究中,一些注射VER-52296的實體瘤患者出現(xiàn)了惡心、嘔吐、夜盲等不良反應。因此,這部分課題的研究目標是建立篩選N末端HSP90抑制劑的熒光偏振體系；對80個具有全新結構的間苯二酚衍生物進行HSP90親和活性的篩選,并評價其對腫瘤細胞的生長抑制作用；對候選化合物Y306zh進行體內、外抗腫瘤藥效學評價；并闡明Y306zh抑制胰腺癌增殖的分子機制,為該類化合物的后續(xù)研發(fā)奠定堅實的實驗基礎。本研究工作由以下四部分內容組成：1)誘導并純化人源重組HSP90a蛋白,建立用于HSP90抑制劑篩選的熒光偏振體系將pET24α(+)-HSP90a重組質粒轉化至BL21(DE3),經1mM IPTG誘導蛋白表達,采用Ni-NTA親和層析樹脂純化HSP90α蛋白。選用VER00051001為探針分子,檢測不同濃度HSP90α蛋白或探針分子對熒光偏振值的影響,并采用HSP90抑制劑NVP-AUY922和GA驗證熒光偏振體系是否建立成功。2)HSP90抑制劑的篩選隨機地選擇7種常用的人源性腫瘤細胞株,采用MTT法,對兩批送樣的具有間苯二酚三氮唑或異VA唑的80個化合物進行細胞毒檢測。分別選取細胞毒活性較好的化合物,采用熒光偏振法對其與HSP90的親和力進行初篩和復篩,得到候選化合物。其中,化合物Y306zh在酶學和細胞水平均顯示出較好的活性,為此對其進行深入地抗腫瘤機制研究。3)候選化合物Y306zh的體內、外抗胰腺癌增殖作用研究采用MTT法,檢測了Y306zh對15株人腫瘤細胞株的生長抑制作用,篩選出Y306zh的敏感瘤株為胰腺癌。并檢測Y306zh對五株具有不同程度HSP90a表達的胰腺癌細胞和正常細胞的生長抑制作用。采用流式細胞術檢測Y306zh對胰腺癌細胞周期阻滯,及誘導胰腺癌細胞凋亡的作用。在胰腺癌Mia-paca2細胞的裸鼠異體移植瘤實驗中,通過檢測荷瘤鼠體重、瘤體積和瘤重的變化,以及瘤組織中增殖指標Ki-67的陽性率,來評價Y306zh的體內抗胰腺癌作用。4)Y306zh抑制胰腺癌增殖的分子機制研究采用熒光偏振技術檢測Y306zh與HSP90 N末端的親和力。采用ATP瓊脂糖小球結合實驗和免疫共沉淀實驗分別檢測Y306zh對胰腺癌細胞內ATP結合型的HSP90活性形式及HSP90與輔助分子伴侶p23、CDC37的相互作用。采用免疫印跡實驗檢測Y306zh對胰腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關的兩個重要客戶蛋白EGFR和IGF-1Rβ的表達,及其下游PI3K/AKT和MAPK信號通路中關鍵分子蛋白表達的影響。預先給予蛋白酶體抑制劑MGl32,檢測是否逆轉Y306zh對客戶蛋白EGFR、IGF-1Rβ、AKT、c-RAF和CDK4的降解作用。采用免疫共沉淀實驗檢測Y306zh誘導客戶蛋白的泛素—蛋白酶體降解是否與HSP90-HSP70-CHIP-客戶蛋白復合體的形成相關。綜上所述,本課題取得的主要進展如下：1)采用pET24a(+)-HSP90a原核表達系統(tǒng),成功地誘導表達并純化了具有活性的HSP90a蛋白,建立并優(yōu)化了用于HSP90抑制劑篩選的熒光偏振體系。2)從80個具有間苯二酚三氮唑或異VA唑結構的化合物中篩選出24個化合物,它們對腫瘤細胞生長抑制作用的IC50值在10-6-10-7M。并且絕大多數化合物(～20個)可與VER00051001競爭性結合HSP90,IC50值在10-7-10"8M。3)Y306zh是一種全新結構的有效的HSP90抑制劑,具有較好的體內、外抗胰腺癌作用,并且具有較好的腫瘤選擇性和安全性。4)Y306zh可以通過抑制ATP與HSP90的結合,并阻礙p23與HSP90的相互作用,從而抑制HSP90的分子伴侶活性,導致胰腺癌中優(yōu)勢客戶蛋白IGF-1Rβ和EGFR去穩(wěn)定化,并抑制其介導的PI3K/AKT和MAPK兩大增殖／存活信號通路,發(fā)揮抗胰腺癌增殖作用。
【圖文】：

有助于ＡＴＰ依賴的諸如ｃｄｃ３７、ｐ２３和免疫親和素等其它輔助分子伴侶的相互逡逑作用，從而形成成熟的超伴侶復合體這種狀態(tài)下，ＨＳＰ９０才能發(fā)揮其分子伴逡逑侶功能，促進其客戶蛋白的構象成熟（如圖３所示）。在腫瘤細胞中ＨＳＰ９０逡逑處于成熟的超伴侶復合體的活化狀態(tài)，而在正常細胞中則主要處于未結合輔助分子逡逑伴侶的靜息狀態(tài)，使得ＨＳＰ９０抑制劑在腫瘤細胞中的親和力比對正常細胞高出１００逡逑倍。因此，ＨＳＰ９０可成為選擇性好的新型抗腫瘤藥物靴點。逡逑恣心逡逑^+’邋凝逡逑ＡＯ巳＇。邐ＩｎｔｏｎｎｅＡａｔｅ逡逑寺ｉ邐齡逡逑管邋１逡逑Ｌａｔｅ邋Ｃ＜？７＾）ｌｅｘ邐Ａｓｙｍｍｅｔｎｃ邋Ｃｏｒｒ＾ｅｘ逡逑Ｃｉｔｅｄ邋ｂｙ邋Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ邋ｅｔ邋Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ邋Ａｃｔａ邋館ＢＡ）邋－邋Ｍｏｌｅｃｉｄａｒ邋ＣｅＵ邋Ｒｅｓｅａｒｃｈ，邋２０１２．逡逑圖３邋ＨＳＰ９０加工客戶蛋白的構象變化示意圖逡逑３、ＨＳＰ９０抑制劑逡逑ＨＳＰ９０抑制劑的出現(xiàn)為一系列實體瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療開辟了新的途逡逑徑，正在被廣泛應用于前列腺癌、乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、慢性髓細胞性白血病、逡逑１３逡逑

２．邋７．邋１確定反應體系中各組分的用量逡逑（１）確定ＨＳＰ９０ａ的用量逡逑在反應體系中給予足量的探針ＶＥＲ０００５１００１邋（終濃度８0１１＼１，５＾ｉＬ），設定不同逡逑的ＨＳＰ９０ａ蛋白濃度（０．０３３５、０．０６７、０．１００５、０．１３４、０．１６７５、０．２０１、０．３３５、０．５０３、逡逑０．６７０、０．８３８、１．００５、１．６乃帖／陣，每孔１陣），分別測定上述ＨＳＰ９０ａ蛋白濃度下的逡逑巧光偏振值（ＦＰ，，ｍＰ），根據反應曲線確定最適酶量。逡逑（２）確定探針的用量逡逑在反應體系中加入５呼終濃度為２．０１帖／ｍＬ的焌Ｐ９０ａ，在不同濃度的探針下（１０、逡逑２０、４０、６０、８０、１００、１６０ｎＭ），分別測定反應體系的ＦＰ值，根據反應曲線確定逡逑最適的探針用量。此外，根據公式計算已建立英光偏振體系的Ｚ’值和信噪比（Ｓ／Ｎ）。逡逑公式如下：逡逑Ｚ，＝！＿（邋３ｏｂｉｎｄｉｎｇ＋３ａｆｒｅｅ）／Ｉ邋＾ｉｂｉｎｄｉｎｇ—＾ｉｆｒｅｅ邋Ｉ邋；邋Ｓ邋／Ｎ邋＝邋（｜ｉｂｉｎｄｉｎｇ—｜ｊ，ｆｒｅｅ）／ａｆｒｅｅ逡逑（訂為標準差，Ｈ為均值，ｂｉｎｄｉｎｇ；游離探針＋ＨＳＰ９０ａ，ｆｒｅｅ：游離探針）逡逑２．邋７．邋２巧光偏振法檢測ＧＡ、ＮＶＰ－ＡＵＹ９２２與ＨＳＰ９０ａ的親和活性逡逑，入濃的陽（ＧＡ／ＮＶＰ－ＡＵＹ９２２），
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R96

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 ;Blockage of IGF-1R signaling sensitizes urinary bladder cancer cells to mitomycin-mediated cytotoxicity[J];Cell Research;2001年02期

2 ;Hsp90 inhibition results in autophagy-mediated proteasome-independent degradation of IκB kinase(IKK)[J];Cell Research;2006年11期

3 ;Down-regulation of p210~(bcr/abl)by curcumin involves disrupting molecular chaperone functions of Hsp90[J];Acta Pharmacologica Sinica;2006年06期

本文編號：2546342