【摘要】：目的:Kv7(Kv7.1-7.5)電壓門控型鉀通道家族由KCNQ基因編碼,在調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性(Kv7.2-Kv7.5)及心肌動(dòng)作電位(Kv7.1)方面發(fā)揮著重要作用。普遍認(rèn)為Kv7.2和Kv7.3通道組成的異四聚體構(gòu)成了神經(jīng)元M電流的分子學(xué)基礎(chǔ),參與調(diào)解多種神經(jīng)元的興奮性。近來,研究發(fā)現(xiàn)Kv7.4、Kv7.5通道在多種血管平滑肌細(xì)胞高表達(dá),并參與調(diào)解血管的張力。而Kv7的調(diào)節(jié)劑可影響平滑肌細(xì)胞的膜電位及血管張力。還有研究顯示,在血管平滑肌細(xì)胞,Kv7.4/Kv7.5是以異四聚體的形式存在的。所以神經(jīng)細(xì)胞(Kv7.2/Kv7.3)與血管平滑肌細(xì)胞(Kv7.4/Kv7.5)Kv7鉀通道亞型表達(dá)的不同,為藥物的選擇性作用提供基礎(chǔ)。非選擇性Kv7鉀離子通道調(diào)節(jié)劑在臨床中可能產(chǎn)生一定的副作用,例如第一個(gè)作為Kv7開放劑上市的藥物瑞替加濱(retigabine,RTG),它在治療癲癇的同時(shí),被發(fā)現(xiàn)有引發(fā)尿潴留的副作用,這是因?yàn)镵v7開放劑可激活膀胱平滑肌上表達(dá)的Kv7鉀通道所致。大多數(shù)已報(bào)道的Kv7調(diào)節(jié)劑對(duì)Kv7家族的各亞型沒有選擇性,尤其是對(duì)Kv7.2-Kv7.4。例如,瑞替加濱和氟吡汀(flupirtine)可以激活Kv7.2~7.5,但對(duì)Kv7.1無顯著作用。所以,Kv7亞型選擇性開放劑,或至少是對(duì)神經(jīng)及血管上的Kv7鉀通道具有亞型選擇性的開放劑,對(duì)臨床疾病的治療具有重要意義。法舒地爾(fasudil),作為RhoA/Rho激酶(ROCK)抑制劑,在臨床上用于腦血管痙攣性疾病及腦卒中后認(rèn)知障礙性疾病的治療,并且還被認(rèn)為具有抗心絞痛的作用。在我們實(shí)驗(yàn)室前期的研究中發(fā)現(xiàn)法舒地爾可以選擇性激活Kv7.4/Kv7.5通道,但對(duì)Kv7.2/Kv7.3通道無顯著作用。本研究將探討法舒地爾激活Kv7.4通道的分子機(jī)制問題。方法:利用電生理穿孔膜片鉗技術(shù),同源建模與分子對(duì)接技術(shù)及定向點(diǎn)突變技術(shù)探討法舒地爾對(duì)Kv7.4鉀離子通道的作用機(jī)制。結(jié)果:1法舒地爾對(duì)表達(dá)于HEK293細(xì)胞的Kv7鉀離子通道電流的選擇性調(diào)節(jié)作用。法舒地爾選擇性激活表達(dá)于HEK293細(xì)胞的Kv7.4和Kv7.4/7.5通道,但對(duì)Kv7.1/KCNE1,Kv7.2及Kv7.2/7.3無顯著影響。2利用同源建模及分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)尋找法舒地爾與Kv7.4鉀離子通道的作用位點(diǎn)。分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)提示的Ile308可能為法舒地爾激活Kv7.4鉀離子通道的關(guān)鍵位點(diǎn)。3構(gòu)建Kv7.4(S6)鉀離子通道突變體。利用定向點(diǎn)突變技術(shù)成功構(gòu)建Kv7.4突變體,分別為:Kv7.4(I308V)、Kv7.4(L306I)、Kv7.4(L306I/I308V)、Kv7.4(G302T/A304T)。4利用膜片鉗技術(shù)觀察fasudil對(duì)Kv7.4(S6)鉀離子通道突變體的作用。法舒地爾(30μM)可以增大Kv7.4(G302T/A304T)電流,增大程度與Kv7.4 wildtype沒有區(qū)別。然而Kv7.4(G302T/A304T)對(duì)RTG(10μM)的敏感性明顯降低了。而Kv7.4(I308V)、Kv7.4(L306I)、Kv7.4(L306I/I308V)對(duì)法舒地爾的敏感性顯著下降了,而對(duì)瑞替加濱的反應(yīng)與Kv7.4 wildtype沒有區(qū)別。以上結(jié)果顯示,S6區(qū)的Ile308和Leu306為法舒地爾調(diào)節(jié)Kv7.4的關(guān)鍵位點(diǎn)。5構(gòu)建Kv7.4(S5-Pore)鉀離子通道突變體。利用定向點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)Kv7.4的S5-Pore區(qū)的6個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了突變,成功構(gòu)建了5個(gè)Kv7.4突變體,分別為:Kv7.4(W242L),Kv7.4(V248C),Kv7.4(F251L),Kv7.4(D262G/A263E),Kv7.4(T278L)。結(jié)論:我們的結(jié)果顯示S6區(qū)的Ile308及Leu306可能為法舒地爾選擇性激活Kv7.4通道的關(guān)鍵位點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R96

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本文編號(hào)：2545240