【摘要】：黑色素瘤(melanoma)是一種高度惡化并具有快速轉移和高度侵襲特性的腫瘤,該瘤進展迅速,預后極差,并對一般的化療藥物具有耐受性,因此缺乏有效的治療藥物。近年來,具有抗癌活性的陽離子抗菌肽由于其獨特的作用機制,逐漸受到人們的廣泛關注。我們前期的研究工作發(fā)現(xiàn),來自于中國林蛙皮膚分泌物的陽離子抗菌肽Temporin-1CEa具有較好的選擇性抗癌活性。在本論文中,我們將對Temporin-1CEa及其六個改造肽的黑色素瘤選擇性殺傷作用進行考察,并進一步對其抗腫瘤血管新生和抑制腫瘤轉移和侵襲的活性進行了初步的評價。我們首先利用MTT法考察了Temporin-1CEa及其改造肽對人黑色素瘤A375細胞和人永生化表皮Hacat細胞的細胞毒作用。實驗結果表明,Temporin-1CEa及其改造肽對A375細胞具有不同程度的殺傷作用,其作用強度依次為LK2(6)AN(2L)LK2(6)A(L)Temporin-1CEaLK1LK3LK2(6)LK2(5),其中Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)對腫瘤細胞具有較好的選擇性。此外,通過Annexin V-FITC單染,采用流式細胞儀對A375細胞和Hacat細胞表面的負電荷成分磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine,PS)含量進行了檢測,結果顯示A375細胞表面PS含量明顯高于Hacat細胞,這可能是Temporin-1CEa及其改造肽選擇性殺傷A375細胞的機制之一。同時,我們的實驗結果還發(fā)現(xiàn),加入NaClO3抑制細胞表面硫酸基團的表達后,能夠明顯增強Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)的抗腫瘤活性,顯示細胞表面硫酸基團能夠減弱抗菌肽與腫瘤細胞之間的相互作用。在明確了Temporin-1CEa及其改造肽對人黑色素瘤A375細胞的選擇性殺傷作用之后,我們又進一步對其抗黑色素瘤轉移和侵襲的活性進行了考察。Transwell遷移/侵襲實驗結果顯示,Temporin-1CEa及其改造肽LK1和LK2(6)A(L)對A375細胞的遷移/侵襲具有明顯的抑制作用,其作用強弱順序為Temporin-1CEaLK2(6)A(L)LK1。此外,采用ELISA方法檢測人基質金屬蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和人血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)表達,實驗結果顯示,Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)能夠抑制A375細胞MMP-2和VEGF的釋放,且抑制效果呈劑量依賴方式,提示Temporin-1CEa及其改造肽的腫瘤轉移和侵襲抑制活性可能與降低黑色素瘤細胞MMP-2和VEGF的表達和釋放有關。由于腫瘤的遷移和侵襲與血管新生密切相關,因此,我們對Temporin-1CEa及其改造肽的抗血管生成活性進行了初步的評價。人臍靜脈血管內皮HUVEC細胞的細胞毒實驗結果表明,Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)能夠抑制HUVEC細胞的增殖,并呈現(xiàn)劑量依賴方式;HUVEC細胞劃痕實驗結果顯示,Temporin-1CEa及其改造肽對HUVEC細胞劃痕具有明顯的抑制作用,其作用強弱順序為:LK2(6)A(L)Temporin-1CEaLK1。同時,Temporin-1CEa及其改造肽LK2(6)A(L)和LK1對HUVEC細胞Transwell遷移/侵襲和基質膠小管形成也具有顯著的抑制作用,其作用強弱順序為:Temporin-1CEaLK2(6)A(L)LK1。雞胚絨毛尿囊膜新生血管形成實驗結果顯示,Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)能夠抑制體內新生血管生成。綜上所述,Temporin-1CEa及其改造肽對A375細胞具有顯著的選擇性殺傷作用,同時可以通過MMP-2和VEGF相關的機制抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移,并具有顯著的抗血管生成活性。這些研究結果有助于進一步對Temporin-1CEa進行結構改造,開發(fā)出具有抗黑色素瘤活性的抗癌肽用于臨床治療。
【學位授予單位】：遼寧師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R915

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