【摘要】：黑色素瘤(melanoma)是一種高度惡化并具有快速轉(zhuǎn)移和高度侵襲特性的腫瘤,該瘤進展迅速,預(yù)后極差,并對一般的化療藥物具有耐受性,因此缺乏有效的治療藥物。近年來,具有抗癌活性的陽離子抗菌肽由于其獨特的作用機制,逐漸受到人們的廣泛關(guān)注。我們前期的研究工作發(fā)現(xiàn),來自于中國林蛙皮膚分泌物的陽離子抗菌肽Temporin-1CEa具有較好的選擇性抗癌活性。在本論文中,我們將對Temporin-1CEa及其六個改造肽的黑色素瘤選擇性殺傷作用進行考察,并進一步對其抗腫瘤血管新生和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲的活性進行了初步的評價。我們首先利用MTT法考察了Temporin-1CEa及其改造肽對人黑色素瘤A375細胞和人永生化表皮Hacat細胞的細胞毒作用。實驗結(jié)果表明,Temporin-1CEa及其改造肽對A375細胞具有不同程度的殺傷作用,其作用強度依次為LK2(6)AN(2L)LK2(6)A(L)Temporin-1CEaLK1LK3LK2(6)LK2(5),其中Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)對腫瘤細胞具有較好的選擇性。此外,通過Annexin V-FITC單染,采用流式細胞儀對A375細胞和Hacat細胞表面的負電荷成分磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine,PS)含量進行了檢測,結(jié)果顯示A375細胞表面PS含量明顯高于Hacat細胞,這可能是Temporin-1CEa及其改造肽選擇性殺傷A375細胞的機制之一。同時,我們的實驗結(jié)果還發(fā)現(xiàn),加入NaClO3抑制細胞表面硫酸基團的表達后,能夠明顯增強Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)的抗腫瘤活性,顯示細胞表面硫酸基團能夠減弱抗菌肽與腫瘤細胞之間的相互作用。在明確了Temporin-1CEa及其改造肽對人黑色素瘤A375細胞的選擇性殺傷作用之后,我們又進一步對其抗黑色素瘤轉(zhuǎn)移和侵襲的活性進行了考察。Transwell遷移/侵襲實驗結(jié)果顯示,Temporin-1CEa及其改造肽LK1和LK2(6)A(L)對A375細胞的遷移/侵襲具有明顯的抑制作用,其作用強弱順序為Temporin-1CEaLK2(6)A(L)LK1。此外,采用ELISA方法檢測人基質(zhì)金屬蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和人血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)表達,實驗結(jié)果顯示,Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)能夠抑制A375細胞MMP-2和VEGF的釋放,且抑制效果呈劑量依賴方式,提示Temporin-1CEa及其改造肽的腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲抑制活性可能與降低黑色素瘤細胞MMP-2和VEGF的表達和釋放有關(guān)。由于腫瘤的遷移和侵襲與血管新生密切相關(guān),因此,我們對Temporin-1CEa及其改造肽的抗血管生成活性進行了初步的評價。人臍靜脈血管內(nèi)皮HUVEC細胞的細胞毒實驗結(jié)果表明,Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)能夠抑制HUVEC細胞的增殖,并呈現(xiàn)劑量依賴方式;HUVEC細胞劃痕實驗結(jié)果顯示,Temporin-1CEa及其改造肽對HUVEC細胞劃痕具有明顯的抑制作用,其作用強弱順序為:LK2(6)A(L)Temporin-1CEaLK1。同時,Temporin-1CEa及其改造肽LK2(6)A(L)和LK1對HUVEC細胞Transwell遷移/侵襲和基質(zhì)膠小管形成也具有顯著的抑制作用,其作用強弱順序為:Temporin-1CEaLK2(6)A(L)LK1。雞胚絨毛尿囊膜新生血管形成實驗結(jié)果顯示,Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)能夠抑制體內(nèi)新生血管生成。綜上所述,Temporin-1CEa及其改造肽對A375細胞具有顯著的選擇性殺傷作用,同時可以通過MMP-2和VEGF相關(guān)的機制抑制腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,并具有顯著的抗血管生成活性。這些研究結(jié)果有助于進一步對Temporin-1CEa進行結(jié)構(gòu)改造,開發(fā)出具有抗黑色素瘤活性的抗癌肽用于臨床治療。
【學(xué)位授予單位】：遼寧師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R915

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本文編號：2540485