【摘要】：毛細(xì)管電泳法以其分離效率高、耗時短、樣品用量少、靈敏度高以及易于實現(xiàn)自動化等諸多特點,在篩選酶抑制劑研究中有著不可替代的優(yōu)勢。本文綜述了毛細(xì)管電泳法在酶抑制劑篩選中的應(yīng)用。主要介紹了應(yīng)用最廣泛的離線分析(Off-line assay)和在線分析(In-line assay),即柱前酶反應(yīng)(Pre-capillary enzyme reaction)和在柱酶分析(In-capillary enzyme reaction)。并對該領(lǐng)域的未來發(fā)展進(jìn)行了展望。
【圖文】：

圖1在線分離的模式，(A)EMMA連續(xù)模式;(B)經(jīng)典區(qū)帶-區(qū)帶模式;(C)部分填充模式;(D)快速切換電極EMMA;(E)進(jìn)樣端軸向擴(kuò)散模;(F)層流剖面的橫向擴(kuò)散［31］Fig．1Modesofon-lineenzymeassay，(A)Continuousengagementelectrophoreticallymediatedmicroanalysis(EMMA);(B)Classicplug-plugmode;(C)Partialfillingtechnique;(D)RapidpolarityswitchingEMMA;(E)At-inletlongitudinaldiffusion;(F)Transversediffusionoflaminarflowprofiles(TDLFP)［31］雙磷酸水解酶抑制劑，為了防止酶吸附在毛細(xì)管內(nèi)壁引起峰展寬，用聚丙烯酰胺修飾毛細(xì)管內(nèi)壁，修飾之后毛細(xì)管內(nèi)壁由原來的負(fù)電荷變?yōu)檎姾桑虼穗姖B流反向流向正極，則轉(zhuǎn)換電壓極性來保證電滲流流向檢測器一端。反應(yīng)物以“底物-酶-底物”的三明治模型在毛細(xì)管進(jìn)樣端進(jìn)樣。由于產(chǎn)物電遷移方向和電滲流方向相同，從而縮短了遷移時間。在血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的酶活動力學(xué)研究中，vanDyck等［8］分別使用長端和短端進(jìn)樣口技術(shù)進(jìn)行實驗，比較兩者發(fā)現(xiàn)，由于短端進(jìn)樣技術(shù)中毛細(xì)管有效分離長度小，分析時間明顯縮短。Wang等［34］使用軸向擴(kuò)散技術(shù)從天然產(chǎn)物中篩選出蛋白激酶抑制劑，并使用LC-MS/MS來鑒定抑制劑的種類。在毛細(xì)管進(jìn)樣端進(jìn)樣反應(yīng)物，通過自由擴(kuò)散實現(xiàn)混合而引發(fā)反應(yīng)，反應(yīng)較短時間后施加電壓分離產(chǎn)物和反應(yīng)物。Nehmé等［35］使用軸向擴(kuò)散技術(shù)研究β-半乳糖苷酶的酶促反應(yīng)動力學(xué)和抑制動力學(xué)，反應(yīng)物的注射順序為:孵育緩沖液、底物、酶、抑制劑、孵育緩沖液，反應(yīng)物通過自由擴(kuò)散實現(xiàn)混合，引發(fā)酶促反應(yīng)，實驗中不需要預(yù)先將待測酶抑制劑與底物混合，不僅減小了工作量，而且可以減少底物的使用量。3．2．2固定化酶微反應(yīng)器(IMER)上述的酶抑制劑篩選方法中，酶不能重復(fù)利用，，浪費(fèi)試劑。而固定之?

毛細(xì)管整體柱的多孔聚合物表面，然后將酶固定在納米金顆粒上。共價鍵合法和交聯(lián)法，雖然固定化酶穩(wěn)定性好，但不可再生和回收利用，而且可能會降低酶活性。申剛義等［45］以氨基硅烷化試劑為介導(dǎo)，在毛細(xì)管內(nèi)壁修飾上氨基，然后采用共價鍵合法將表皮生長因子受體固定在毛細(xì)管內(nèi)壁，結(jié)合毛細(xì)管電泳，利用表皮生長因子受體微反應(yīng)器在線測定了抑制劑吉非替尼對表皮生長因子受體的抑制性能。Min等［46］利用雙功能試劑戊二醛制備了胰蛋白酶微反應(yīng)器，并且成功地從19種天然產(chǎn)物提取物中篩選出了胰蛋白酶抑制劑。大體步驟如下(圖2):首先通過氨丙基三甲氧基硅烷(3-APTES)與毛細(xì)管內(nèi)壁的硅羥基結(jié)合，然后3-APTES的氨基和戊二醛的醛基作用，結(jié)合上戊二醛之后，戊二醛的另一個醛基與酶的氨基結(jié)合，酶被固定，毛細(xì)管的剩余部分作為分離通道。Wang等［47］使用硅烷化試劑和戊二醛交聯(lián)酶，制備了葡萄糖氧化酶(GOx)固定化酶微反應(yīng)器，以Ag+和Cu2+作為標(biāo)準(zhǔn)抑制劑在固定化反應(yīng)器中研究了其對GOx的抑制作用。Zhao等［48］利用雙功能團(tuán)試劑戊二醛交聯(lián)技術(shù)在毛細(xì)管出口端制備了固定化神經(jīng)氨酸苷酶微反應(yīng)器用以篩選其抑制劑，固定之后的酶穩(wěn)定性增加，而且短端進(jìn)樣大大提高了篩選效率。圖2交聯(lián)法固定化酶微反應(yīng)器［46］Fig．2Immobilizedenzymemicroreactorbycross-linking［46］除上述固定化方法之外，也有新的固定化方法在不斷發(fā)展完善。Liu等［49］使用顆粒填充技術(shù)制備了毛細(xì)管固定化酶微反應(yīng)器:利用粒徑為毛細(xì)管直徑的兩個硅膠粒子作為結(jié)塊，將固定酶的大孔珠固定在結(jié)塊之間，從而制備了固定化酶微反應(yīng)器。大孔珠可以保證溶液通過，以減小背壓，制備過程簡便快速，而且通過調(diào)節(jié)填充的大孔珠的量，可以調(diào)節(jié)酶的固定量和固定化微反應(yīng)器的長度?
【作者單位】： 中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所中國科學(xué)院西北特色植物資源化學(xué)重點實驗室和甘肅省天然藥物重點實驗室;中國科學(xué)院大學(xué);
【基金】：國家自然科學(xué)基金(Nos.21105106,21375136)資助~~
【分類號】：R917;O658.9

【參考文獻(xiàn)】

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【共引文獻(xiàn)】

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【二級參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2537493