【摘要】：肝纖維化(hepatic fibrosis, HF)是肝臟對各種病因所致的慢性損傷產(chǎn)生的修復反應,以膠原為主的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)在肝內(nèi)大量沉積為其主要特征。肝纖維化持續(xù)發(fā)展最終可形成肝硬化甚至轉(zhuǎn)化成原發(fā)性肝細胞癌,已成為危害人類健康的世界性問題。然而對于肝纖維化迄今仍沒有發(fā)現(xiàn)滿意的治療藥物和方法,闡明肝纖維化形成中相關的分子機制,對減少肝硬化及原發(fā)性肝細胞癌的發(fā)生具有重要的意義。 肝臟受損時,肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化增殖在肝纖維化形成過程中起主導性作用。積極尋找導致HSC活化增殖等病理生理過程的關鍵環(huán)節(jié)是防治該病的重點之一。有研究表明,HSC中離子濃度的改變可影響HSC的活化增殖,因此HSC細胞膜上的離子通道成為調(diào)控HSC增殖與凋亡的新靶點。陽離子通道TRPV4是瞬時受體電位通道TRP家族(TRP channels)中的成員之一,廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、腎臟、心臟等多種組織,參與聽覺、觸覺、痛覺傳導,及細胞的增殖、遷移、凋亡等多種病理生理過程。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),TRP家族成員TRPM7具有抑制HSC增殖并促進其凋亡的作用。本實驗重點研究TRPV4在HSC活化增殖中的作用,及其調(diào)控機制,為肝纖維化防治提供新的靶點。 主要研究內(nèi)容概括如下： 1.TRPV4在體與離體表達變化 以人體肝血管瘤組織為正常肝組織,肝炎后肝硬化脾亢患者及肝癌患者癌旁2cm以外,為肝纖維化組織(經(jīng)病理學組織染色確認)。采用免疫組化、RT-PCT、 Western blot等方法檢鋇TRPV4的基因與蛋白的表達變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與正常肝組織相比,人體肝纖維化組織中TRPV4基因與蛋白的表達明顯增高。 每周2次皮下注射含50%CCl4的植物油溶液(1ml/kg),建立大鼠肝纖維化模型(共12周)；動物實驗結(jié)果證實,與正常肝組織相比,大鼠肝纖維化組織中TRPV4mRNA及蛋白表達水平均明顯增高。 體外實驗部分以大鼠肝星狀細胞株HSC-T6為研究對象,使用TGF-β1(10ng/ml)處理細胞(24h),qRT-PCR、Western blot結(jié)果表明,與未誘導組比較,TGF-β1明顯誘導HSC-T6中TRPV4mRNA與蛋白水平。提示TRPV4可能參與調(diào)控HSC的活化增殖,影響肝纖維化的進程。 2. TRPV4對HSC-T6增殖的影響及部分機制研究 TRPV4特異性阻斷劑luM釕紅(Ru)預處理HSC-T6細胞,加入TGF-β1誘導24h后,MTT檢測結(jié)果表明,與正常HSC-T6細胞比較,釕紅預處理組HSC-T6細胞的增殖明顯受到抑制；qRT-PCR、Western blot檢測顯示,HSC活化標志物a-SMA的]mRNA與蛋白明顯降低。利用LipofectamineTM2000介導的siRNA技術特異性沉默HSC-T6內(nèi)TRPV4,結(jié)果表明特異性阻斷TRPV4,可明顯抑制HSC-T6增殖與a-SMA mRNA與蛋白的表達水平。進一步研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染TRPV4-siRNA,可明顯抑制AKT的磷酸化水平。提示TRPV4可能通過阻斷PI3K/AKT信號通路抑制HSC的活化增殖。 3. TRPV4上游調(diào)控機制研究 課題組前期研究證實,表觀遺傳修飾在肝纖維化形成過程中具有重要作用,miRbase, miRANDA, and Targetscan5.1軟件預測均顯示,TRPV4是miR-203的作用靶標。為探討調(diào)控TRPV4的調(diào)控機制,我們研究了miR-203在肝纖維化組織與HSC的表達變化,及其對TRPV4的調(diào)控作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在體肝纖維化組織與離體TGF-β1誘導的HSC-T6中,miR-203表達均明顯降低。LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染miR-203的模擬物mimics到HSC-T6細胞內(nèi),可明顯降低HSC-T6的增殖、α-SMA mRNA與蛋白的表達；并可抑制TRPV4的表達；而應用TRPV4的激動劑,則明顯降低,miR-203的模擬物mimics對HSC-T6增殖的抑制率。熒光素酶實驗結(jié)果進一步證實miR-203靶向TRPV4。提示miR-203具有調(diào)控HSC-T6活化增殖的作用,其功能與其靶向TRPV4有關。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R96

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 張磊;李俊;朱鵬里;黃成;呂雄文;;四氯化碳誘導大鼠肝纖維化進展期和恢復期模型的建立[J];中國藥理學通報;2011年12期

2 ;Formaldehyde up-regulates TRPV1 through MAPK and PI3K signaling pathways in a rat model of bone cancer pain[J];Neuroscience Bulletin;2012年02期

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本文編號：2534242