【摘要】：肝纖維化(hepatic fibrosis, HF)是肝臟對(duì)各種病因所致的慢性損傷產(chǎn)生的修復(fù)反應(yīng),以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)在肝內(nèi)大量沉積為其主要特征。肝纖維化持續(xù)發(fā)展最終可形成肝硬化甚至轉(zhuǎn)化成原發(fā)性肝細(xì)胞癌,已成為危害人類(lèi)健康的世界性問(wèn)題。然而對(duì)于肝纖維化迄今仍沒(méi)有發(fā)現(xiàn)滿(mǎn)意的治療藥物和方法,闡明肝纖維化形成中相關(guān)的分子機(jī)制,對(duì)減少肝硬化及原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)生具有重要的意義。 肝臟受損時(shí),肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化增殖在肝纖維化形成過(guò)程中起主導(dǎo)性作用。積極尋找導(dǎo)致HSC活化增殖等病理生理過(guò)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是防治該病的重點(diǎn)之一。有研究表明,HSC中離子濃度的改變可影響HSC的活化增殖,因此HSC細(xì)胞膜上的離子通道成為調(diào)控HSC增殖與凋亡的新靶點(diǎn)。陽(yáng)離子通道TRPV4是瞬時(shí)受體電位通道TRP家族(TRP channels)中的成員之一,廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、腎臟、心臟等多種組織,參與聽(tīng)覺(jué)、觸覺(jué)、痛覺(jué)傳導(dǎo),及細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡等多種病理生理過(guò)程。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),TRP家族成員TRPM7具有抑制HSC增殖并促進(jìn)其凋亡的作用。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究TRPV4在HSC活化增殖中的作用,及其調(diào)控機(jī)制,為肝纖維化防治提供新的靶點(diǎn)。 主要研究?jī)?nèi)容概括如下： 1.TRPV4在體與離體表達(dá)變化 以人體肝血管瘤組織為正常肝組織,肝炎后肝硬化脾亢患者及肝癌患者癌旁2cm以外,為肝纖維化組織(經(jīng)病理學(xué)組織染色確認(rèn))。采用免疫組化、RT-PCT、 Western blot等方法檢鋇TRPV4的基因與蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與正常肝組織相比,人體肝纖維化組織中TRPV4基因與蛋白的表達(dá)明顯增高。 每周2次皮下注射含50%CCl4的植物油溶液(1ml/kg),建立大鼠肝纖維化模型(共12周)；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),與正常肝組織相比,大鼠肝纖維化組織中TRPV4mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯增高。 體外實(shí)驗(yàn)部分以大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6為研究對(duì)象,使用TGF-β1(10ng/ml)處理細(xì)胞(24h),qRT-PCR、Western blot結(jié)果表明,與未誘導(dǎo)組比較,TGF-β1明顯誘導(dǎo)HSC-T6中TRPV4mRNA與蛋白水平。提示TRPV4可能參與調(diào)控HSC的活化增殖,影響肝纖維化的進(jìn)程。 2. TRPV4對(duì)HSC-T6增殖的影響及部分機(jī)制研究 TRPV4特異性阻斷劑luM釕紅(Ru)預(yù)處理HSC-T6細(xì)胞,加入TGF-β1誘導(dǎo)24h后,MTT檢測(cè)結(jié)果表明,與正常HSC-T6細(xì)胞比較,釕紅預(yù)處理組HSC-T6細(xì)胞的增殖明顯受到抑制；qRT-PCR、Western blot檢測(cè)顯示,HSC活化標(biāo)志物a-SMA的]mRNA與蛋白明顯降低。利用LipofectamineTM2000介導(dǎo)的siRNA技術(shù)特異性沉默HSC-T6內(nèi)TRPV4,結(jié)果表明特異性阻斷TRPV4,可明顯抑制HSC-T6增殖與a-SMA mRNA與蛋白的表達(dá)水平。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染TRPV4-siRNA,可明顯抑制AKT的磷酸化水平。提示TRPV4可能通過(guò)阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路抑制HSC的活化增殖。 3. TRPV4上游調(diào)控機(jī)制研究 課題組前期研究證實(shí),表觀遺傳修飾在肝纖維化形成過(guò)程中具有重要作用,miRbase, miRANDA, and Targetscan5.1軟件預(yù)測(cè)均顯示,TRPV4是miR-203的作用靶標(biāo)。為探討調(diào)控TRPV4的調(diào)控機(jī)制,我們研究了miR-203在肝纖維化組織與HSC的表達(dá)變化,及其對(duì)TRPV4的調(diào)控作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在體肝纖維化組織與離體TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6中,miR-203表達(dá)均明顯降低。LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染miR-203的模擬物mimics到HSC-T6細(xì)胞內(nèi),可明顯降低HSC-T6的增殖、α-SMA mRNA與蛋白的表達(dá)；并可抑制TRPV4的表達(dá)；而應(yīng)用TRPV4的激動(dòng)劑,則明顯降低,miR-203的模擬物mimics對(duì)HSC-T6增殖的抑制率。熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)miR-203靶向TRPV4。提示miR-203具有調(diào)控HSC-T6活化增殖的作用,其功能與其靶向TRPV4有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R96

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 張磊;李俊;朱鵬里;黃成;呂雄文;;四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化進(jìn)展期和恢復(fù)期模型的建立[J];中國(guó)藥理學(xué)通報(bào);2011年12期

2 ;Formaldehyde up-regulates TRPV1 through MAPK and PI3K signaling pathways in a rat model of bone cancer pain[J];Neuroscience Bulletin;2012年02期

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本文編號(hào)：2534242