【摘要】：成纖維細(xì)胞生長因子18(fibroblast growth factor 18,FGF18),是1998年首次從鼠胚胎中分離出來的一種成纖維細(xì)胞生長因子,與FGF17同屬于FGF8亞家族。研究表明FGF18在血管生成、形態(tài)發(fā)生和細(xì)胞發(fā)育中發(fā)揮了重要的作用。此外,它還是發(fā)育組織中的一種分泌性信號(hào)分子,在軟骨和骨骼發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用。但是由于FGF18蛋白穩(wěn)定性差,產(chǎn)量低,一直影響著FGF18在藥物上的研究進(jìn)展。雖然FGF18也曾在植物細(xì)胞、原核細(xì)胞中嘗試表達(dá),但該蛋白的穩(wěn)定性和產(chǎn)量一直沒有得到解決。因此,本論文提出了一種新的、快速、有效的表達(dá)純化策略。本文使用昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(IC-BEVS),讓FGF18在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá),并對昆蟲表達(dá)系統(tǒng)的特性和FGF18蛋白的性質(zhì)進(jìn)行研究。雙酶切含有優(yōu)化后的hFGF18基因的載體,將目的基因連接到pFastBac桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體上,獲得的p FastBac-hFGF18質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化到含有Bacmid的DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中,利用細(xì)菌轉(zhuǎn)座子原理,在大腸桿菌內(nèi)完成Bacmid-rhFGF18重組,通過藍(lán)白斑篩選,挑選出陽性重組質(zhì)粒。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Sf9昆蟲細(xì)胞內(nèi),再經(jīng)過重復(fù)侵染獲得高滴度病毒。因?yàn)槔ハx細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中蛋白的收獲時(shí)間和表達(dá)條件影響著重組蛋白的產(chǎn)量和質(zhì)量。因此,為了提高蛋白產(chǎn)量,我們對rhFGF18蛋白的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化。首先在確定感染復(fù)數(shù)(MOI)條件下,侵染對數(shù)生長期的昆蟲細(xì)胞,收獲侵染24,36,48,60,72,84,96,108,120h后的蛋白樣品,采用Western Blot法進(jìn)行鑒定得到最佳感染時(shí)間(TOI);再取五瓶生長狀態(tài)相同的昆蟲細(xì)胞,用不同的MOI侵染細(xì)胞,收獲的樣品用Western Blot進(jìn)行鑒定找到最佳的MOI。在最佳的表達(dá)條件下,對樣品擴(kuò)大培養(yǎng)。利用FGF18的等電點(diǎn)和肝素親和特性,我們采用肝素親和柱和SP-FF陽離子交換柱對蛋白樣品進(jìn)行純化,并通過Western Blot確認(rèn)純化后的rhFGF18蛋白。最后,對純化后的rhFGF18蛋白體外活性進(jìn)行研究,運(yùn)用MTT的方法檢測rhFGF18蛋白對MC3T3-E1小鼠前成骨細(xì)胞的促增殖效果;采用堿性磷酸酶染色法和競爭法測定MC3T3-E1培養(yǎng)上清中堿性磷酸酶(ALP)和骨鈣素(OCN)的含量。昆蟲偏好密碼子優(yōu)化的hFGF18,通過轉(zhuǎn)座子原理,成功地構(gòu)建了重組載體BacmidrhFGF18,并且分子量約為22 kDa的rhFGF18在昆蟲細(xì)胞中得到了表達(dá)。病毒侵染Sf9細(xì)胞72h后蛋白表達(dá)量達(dá)到最高,當(dāng)MOI為3時(shí),重組蛋白的表達(dá)量最好。在蛋白純化過程中,用含不同鹽離子濃度的緩沖液對肝素親和柱進(jìn)行梯度洗脫,目的蛋白被含有1.0M NaCl的25mM Tris洗脫下來。超濾除鹽后,rhFGF18被含有0.8M NaCl的25mM Tris從陽離子柱中洗脫下來。BCA蛋白濃度測定所得的純化蛋白濃度約為80mg/L。體外活性實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果表明,rhFGF18對MC3T3-E1具有明顯的促增值作用,給藥7天后,和對照組相比,rhFGF18均能提高細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶和骨鈣素的含量,初步探討了rhFGF18作為骨質(zhì)疏松藥物的可能性。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R96

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本文編號(hào)：2533106