【摘要】：成纖維細胞生長因子18(fibroblast growth factor 18,FGF18),是1998年首次從鼠胚胎中分離出來的一種成纖維細胞生長因子,與FGF17同屬于FGF8亞家族。研究表明FGF18在血管生成、形態(tài)發(fā)生和細胞發(fā)育中發(fā)揮了重要的作用。此外,它還是發(fā)育組織中的一種分泌性信號分子,在軟骨和骨骼發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用。但是由于FGF18蛋白穩(wěn)定性差,產(chǎn)量低,一直影響著FGF18在藥物上的研究進展。雖然FGF18也曾在植物細胞、原核細胞中嘗試表達,但該蛋白的穩(wěn)定性和產(chǎn)量一直沒有得到解決。因此,本論文提出了一種新的、快速、有效的表達純化策略。本文使用昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)(IC-BEVS),讓FGF18在昆蟲細胞中進行表達,并對昆蟲表達系統(tǒng)的特性和FGF18蛋白的性質(zhì)進行研究。雙酶切含有優(yōu)化后的hFGF18基因的載體,將目的基因連接到pFastBac桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體上,獲得的p FastBac-hFGF18質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化到含有Bacmid的DH10Bac感受態(tài)細胞中,利用細菌轉(zhuǎn)座子原理,在大腸桿菌內(nèi)完成Bacmid-rhFGF18重組,通過藍白斑篩選,挑選出陽性重組質(zhì)粒。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Sf9昆蟲細胞內(nèi),再經(jīng)過重復侵染獲得高滴度病毒。因為昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)中蛋白的收獲時間和表達條件影響著重組蛋白的產(chǎn)量和質(zhì)量。因此,為了提高蛋白產(chǎn)量,我們對rhFGF18蛋白的表達條件進行了優(yōu)化。首先在確定感染復數(shù)(MOI)條件下,侵染對數(shù)生長期的昆蟲細胞,收獲侵染24,36,48,60,72,84,96,108,120h后的蛋白樣品,采用Western Blot法進行鑒定得到最佳感染時間(TOI);再取五瓶生長狀態(tài)相同的昆蟲細胞,用不同的MOI侵染細胞,收獲的樣品用Western Blot進行鑒定找到最佳的MOI。在最佳的表達條件下,對樣品擴大培養(yǎng)。利用FGF18的等電點和肝素親和特性,我們采用肝素親和柱和SP-FF陽離子交換柱對蛋白樣品進行純化,并通過Western Blot確認純化后的rhFGF18蛋白。最后,對純化后的rhFGF18蛋白體外活性進行研究,運用MTT的方法檢測rhFGF18蛋白對MC3T3-E1小鼠前成骨細胞的促增殖效果;采用堿性磷酸酶染色法和競爭法測定MC3T3-E1培養(yǎng)上清中堿性磷酸酶(ALP)和骨鈣素(OCN)的含量。昆蟲偏好密碼子優(yōu)化的hFGF18,通過轉(zhuǎn)座子原理,成功地構(gòu)建了重組載體BacmidrhFGF18,并且分子量約為22 kDa的rhFGF18在昆蟲細胞中得到了表達。病毒侵染Sf9細胞72h后蛋白表達量達到最高,當MOI為3時,重組蛋白的表達量最好。在蛋白純化過程中,用含不同鹽離子濃度的緩沖液對肝素親和柱進行梯度洗脫,目的蛋白被含有1.0M NaCl的25mM Tris洗脫下來。超濾除鹽后,rhFGF18被含有0.8M NaCl的25mM Tris從陽離子柱中洗脫下來。BCA蛋白濃度測定所得的純化蛋白濃度約為80mg/L。體外活性實驗測定結(jié)果表明,rhFGF18對MC3T3-E1具有明顯的促增值作用,給藥7天后,和對照組相比,rhFGF18均能提高細胞內(nèi)堿性磷酸酶和骨鈣素的含量,初步探討了rhFGF18作為骨質(zhì)疏松藥物的可能性。
【學位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R96

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 徐冰;用昆蟲細胞制備生物制品[J];國外醫(yī)學.預防.診斷.治療用生物制品分冊;1996年02期

2 劉鐘tx ,張曉麗;使用能表達人類淋巴細胞表面抗原的昆蟲細胞制備單克隆抗體[J];國外醫(yī)學(免疫學分冊);1993年03期

3 王麗穎,楊貴貞;酵母蛋白質(zhì)組氨酸激酶在昆蟲細胞中的表達[J];中國免疫學雜志;1997年05期

4 張菊,韓葦,顏真,趙永同,王俊樓,張英起,蘇成芝;血管生長抑制因子基因的克隆及其在昆蟲細胞中的表達[J];第四軍醫(yī)大學學報;1999年04期

5 張治平,李元;鼠Ⅰ型可溶性白細胞介素1受體基因在昆蟲細胞的克隆和表達[J];遺傳學報;1999年01期

6 ;簡訊[J];國外醫(yī)學.生物制品分冊;1984年03期

7 韓揚,周春霞,馬文波,王冬梅,張叔人;人T細胞受體ζ鏈基因在昆蟲細胞中的表達[J];中國腫瘤生物治療雜志;2003年02期

8 盧茲凡,陳蘇民,陳南春,路凡,余清;人骨形成蛋白2在昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)中的表達及初步鑒定[J];細胞與分子免疫學雜志;1999年03期

9 劉穎,王寶利,郭剛,梁東春,張鏡宇;人降鈣素在昆蟲細胞中的表達[J];天津醫(yī)藥;2003年07期

10 朱分祿,任浩,朱詩應(yīng),宋燕斌,戚中田;庚型肝炎病毒NS3蛋白在昆蟲細胞中的表達[J];病毒學報;2000年03期

相關(guān)會議論文 前10條

1 李元杰;李君浩;;昆蟲細胞培養(yǎng)及其在農(nóng)藥研究開發(fā)中的應(yīng)用[A];華中昆蟲研究（第6卷）[C];2010年

2 諶立偉;高燦;周德和;池志強;;表達在昆蟲細胞上人μ阿片受體的二聚化作用[A];中國藥理學會第十屆全國神經(jīng)學術(shù)會議暨浙江省藥理學會2002年年會論文摘要集[C];2002年

3 陳彥;劉玉平;吳志聰;白楊;戴仁科;;人葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1、1A6、1A9、2B7和2B11在昆蟲細胞中的表達及其代謝活性研究[A];第八次全國藥物與化學異物代謝學術(shù)會議論文摘要[C];2006年

4 李國勛;李長友;;昆蟲細胞培養(yǎng)與生物技術(shù)研究進展[A];中國微生物學會《第二屆全國農(nóng)業(yè)微生物研究及產(chǎn)業(yè)化研討會》和《第十一屆全國殺蟲微生物學術(shù)研討會》暨《湖北省暨武漢市微生物學會和內(nèi)蒙古微生物學會2008年會》論文摘要[C];2008年

5 靖志強;張佑紅;;重組桿狀病毒感染懸浮昆蟲細胞感染策略優(yōu)化及放大試驗[A];2009’環(huán)保農(nóng)藥新技術(shù)、新產(chǎn)品暨生物農(nóng)藥技術(shù)研討會論文集[C];2009年

6 余澤華;劉冬連;陳曲候;;昆蟲細胞無血清培養(yǎng)基的研究[A];全國生物防治學術(shù)討論會論文摘要集[C];1995年

7 張佑紅;朱雄偉;;昆蟲細胞感染在低感染復數(shù)下的動力學[A];湖北省生物工程學會2004年年會學術(shù)報告及論文摘要匯編[C];2004年

8 馬艷;丁偉峰;馮穎;張欣;馬濤;;不同冷凍保護劑和凍存時間對昆蟲細胞系NIAS-MaBr-85凍存后細胞活力的影響[A];云南省昆蟲學會2009年年會論文集[C];2009年

9 葉林柏;郜金榮;;HCMVpol基因在昆蟲細胞中表達、酶的純化和生化性質(zhì)[A];全國生物防治學術(shù)討論會論文摘要集[C];1995年

10 梁偉峰;朱國獻;朱函坪;姚蘋蘋;朱智勇;;漢坦病毒G2糖蛋白在昆蟲細胞中的表達及其應(yīng)用[A];第七次全國腎綜合征出血熱學術(shù)會議論文匯編[C];2006年

相關(guān)博士學位論文 前6條

1 張欣;昆蟲細胞系的建立及其生物學特性與應(yīng)用研究[D];中國林業(yè)科學研究院;2011年

2 王彥彬;豬干擾素a和γ在桿狀病毒/昆蟲細胞系統(tǒng)中表達及重組蛋白初步應(yīng)用[D];河南農(nóng)業(yè)大學;2008年

3 薛萍;角質(zhì)細胞生長因子-1（KGF-1）在昆蟲細胞中的表達及其活性研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學;2012年

4 徐侃彥;AVP(4-8)調(diào)控基因的新途徑研究及大鼠CCTβ在昆蟲細胞中的表達[D];中國科學院研究生院（上海生命科學研究院）;2002年

5 林董;RSV五個基因及GFP-CP、GFP-SP融合基因在sf9昆蟲細胞中的表達[D];福建農(nóng)林大學;2007年

6 齊影;戊型肝炎病毒（HEV）組成和結(jié)構(gòu)的分析及其ORF2蛋白在昆蟲細胞中表達的研究[D];吉林大學;2015年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 潘婷;中東呼吸綜合征冠狀病毒受體結(jié)合區(qū)蛋白在昆蟲細胞中的重組表達與免疫保護作用研究[D];安徽醫(yī)科大學;2015年

2 趙潔;AcMNPV介導BmK IT的表達對Sf9細胞作用機制的研究[D];山西大學;2015年

3 戴偉宏;基于Bac-to-Bac系統(tǒng)研究BmSPR基因在昆蟲細胞的表達[D];安徽農(nóng)業(yè)大學;2014年

4 黃金枝;重組人成纖維細胞生長因子18在昆蟲細胞中的表達及其藥理活性研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學;2016年

5 宋德偉;昆蟲細胞的建庫技術(shù)研究及昆蟲細胞的原代培養(yǎng)[D];中國林業(yè)科學研究院;2004年

6 李守信;轉(zhuǎn)p～（35）基因昆蟲細胞系的研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2005年

7 李玲;豬圓環(huán)病毒2型的分子流行病學分析及病毒衣殼蛋白在昆蟲細胞中的表達[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2012年

8 邱平明;人ZP3嵌合肽在昆蟲細胞中的表達及其活性研究[D];暨南大學;2004年

9 張欣;兩種鞘翅目昆蟲細胞培養(yǎng)及昆蟲細胞系染色體分析[D];中國林業(yè)科學研究院;2006年

10 許雪蓮;利用桿狀病毒—昆蟲細胞系統(tǒng)表達人細胞色素P450 2C9酶[D];吉林大學;2008年

，

本文編號：2533106