【摘要】：目的：寡肽轉(zhuǎn)運蛋白1(peptide transporter1, PEPT1)是一種主要表達于小腸上皮細胞刷狀緣膜側(cè)、以氫離子濃度梯度差為動力的主動轉(zhuǎn)運蛋白,其底物非常廣泛,可介導(dǎo)二肽、三肽以及類肽藥物的口服吸收。PEPT1屬于高容量、低親和力的轉(zhuǎn)運蛋白,因此其對大部分底物藥物的轉(zhuǎn)運效率有限,導(dǎo)致藥物口服生物利用度較低。目前專屬的PEPT1轉(zhuǎn)運功能促進劑未見文獻報道,無藥理活性、低毒且具有較強促PEPT1轉(zhuǎn)運功能的物質(zhì)的研究可能是提高PEPT1底物藥物口服吸收的新思路。本實驗室在前期研究過程中發(fā)現(xiàn)某些藥用輔料對PEPT1底物藥物有一定的促吸收作用,據(jù)此,本文以常用藥用輔料為研究對象,考察所選輔料對PEPT1轉(zhuǎn)運功能的影響,利用分子生物學(xué)技術(shù)探討活性藥用輔料促吸收機制,并通過整體動物模型對其促PEPT1作用進一步驗證和研究,希望篩選出具有較強PEPT1促進作用的輔料。 方法：本課題采用Caco-2細胞模型,以MTT法考察了22種常用藥用輔料對細胞活性的影響,確定細胞攝取試驗中輔料的濃度梯度：進而以PEPT1經(jīng)典底物Gly-Sar為探針?biāo)幬?利用HPLC-MS/MS法測定藥物在細胞破碎液中的含量,計算細胞攝取率(Uptake ratio, UR)評價藥用輔料對Caco-2細胞膜上PEPT1功能的影響。通過Western blot以及熒光實時定量PCR測定活性藥用輔料對Caco-2細胞中PEPT1蛋白表達量以及mRNA表達量的影響。運用熒光探針從胞內(nèi)pH以及膜流動性兩個方面考察了活性輔料對Caco-2細胞中PEPT1影響的作用機制。為了進一步驗證篩選出的活性藥用輔料對PEPT1底物藥物口服吸收的影響,本文采用福辛普利鈉為探針?biāo)幬?用HPLC-MS/MS法同時測定大鼠體內(nèi)原藥以及活性代謝物福辛普利拉的濃度,考察RH40、EL35、PEG400、吐溫20以及吐溫80對PEPT1轉(zhuǎn)運功能的影響,并采用蛋白印跡法測定大鼠小腸各段PEPT1蛋白表達水平的變化。 結(jié)果：細胞攝取試驗結(jié)果表明加入EL35、RH40、PEG400、PEG6000、 Eudragit L100、Eudragit L100-55、Eudragit RL PO、HPMC E30、吐溫20、吐溫80. CMC-Na. CMS-Na以及殼聚糖,可顯著影響Gly-Sar的細胞攝取量,推測這些輔料對PEPT1的功能有著不可忽視的作用。其余9種輔料(泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、PEG800. PEG1500、PEG4000、PVP K30、環(huán)糊精、TranscutolP、微晶纖維素)對探針二肽的攝取量無顯著性影響。Western blot結(jié)果表明PEG400、CMS-Na、EL35、RH40.吐溫20、吐溫80、Eudragit L100以及EudragitL100-55均可增加PEPT1膜蛋白的含量,而活性藥用輔料并不能顯著誘導(dǎo)或抑制PEPT1基因的表達,推測蛋白水平的增加主要是由于胞質(zhì)內(nèi)的PEPT1向細胞膜上轉(zhuǎn)移和嵌入的結(jié)果。部分活性藥用輔料可在一定程度上降低胞內(nèi)pH值,影響程度依次為吐溫20EL35吐溫80PEG400≈RH40。此外,PEG6000、殼聚糖、CMS-Na以及Eudragit L100可以減低孵育液的pH值,推測細胞內(nèi)外的氫離子濃度梯度差增加可能是上述9種輔料促進PEPT1底物藥物攝取的原因之一。膜流動性結(jié)果表明PEG400、EL35、RH40、吐溫20、吐溫80均可增加Caco-2細胞的膜流動性。因此,輔料PEG400、EL35、RH40、吐溫20、吐溫80的顯著促PEPT1轉(zhuǎn)運作用與細胞膜上蛋白含量增加、細胞內(nèi)外氫離子濃度梯度增大以及細胞膜流動性增加相關(guān)。大鼠藥動學(xué)試驗結(jié)果顯示,PEG400、RH40、EL35、吐溫20及吐溫80各個輔料組福辛普利鈉的相對生物利用度分別為90.98%、725.27%、190.65%、240.00%和156.17%,代謝物福辛普利拉的相對生物利用度分別為171.25%、207.33%、253.33%、253.76%、200.05%。灌胃給予上述5種活性輔料24h后,各個輔料對大鼠十二指腸PEPT1蛋白表達豐度沒有顯著影響,對空腸和回腸PEPT1蛋白表達均表現(xiàn)出一定的下調(diào)作用,提示上述輔料確實可以通過影響腸道PEPT1轉(zhuǎn)運功能促進底物藥物的吸收。 結(jié)論：綜上所述,本文通過考察22種藥用輔料在Caco-2細胞模型中促進PEPT1轉(zhuǎn)運的作用,篩選出14種輔料進一步進行PEPT1促吸收作用機制研究,最后在整體動物水平選取5種具有顯著促進PEPT1作用的活性藥用輔料驗證了其對底物的吸收促進作用。研究結(jié)果顯示RH40、EL35等多種輔料均具有促進PEPT1轉(zhuǎn)運作用功能,可促進底物藥物的吸收,提高藥物的口服生物利用度;上述藥用輔料對PEPT1功能的影響與促進PEPT1蛋白向細胞膜轉(zhuǎn)移、改變胞內(nèi)外氖離子濃度差以及改變膜流動性等多方面作用有關(guān)。本文研究結(jié)果可為了解PEPT1底物藥物與輔料之間的相互作用、底物藥物的合理劑型設(shè)計提供理論和實驗依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R96

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本文編號：2527440