【摘要】：目的：寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(peptide transporter1, PEPT1)是一種主要表達(dá)于小腸上皮細(xì)胞刷狀緣膜側(cè)、以氫離子濃度梯度差為動(dòng)力的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,其底物非常廣泛,可介導(dǎo)二肽、三肽以及類肽藥物的口服吸收。PEPT1屬于高容量、低親和力的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,因此其對(duì)大部分底物藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)效率有限,導(dǎo)致藥物口服生物利用度較低。目前專屬的PEPT1轉(zhuǎn)運(yùn)功能促進(jìn)劑未見文獻(xiàn)報(bào)道,無藥理活性、低毒且具有較強(qiáng)促PEPT1轉(zhuǎn)運(yùn)功能的物質(zhì)的研究可能是提高PEPT1底物藥物口服吸收的新思路。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究過程中發(fā)現(xiàn)某些藥用輔料對(duì)PEPT1底物藥物有一定的促吸收作用,據(jù)此,本文以常用藥用輔料為研究對(duì)象,考察所選輔料對(duì)PEPT1轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響,利用分子生物學(xué)技術(shù)探討活性藥用輔料促吸收機(jī)制,并通過整體動(dòng)物模型對(duì)其促PEPT1作用進(jìn)一步驗(yàn)證和研究,希望篩選出具有較強(qiáng)PEPT1促進(jìn)作用的輔料。 方法：本課題采用Caco-2細(xì)胞模型,以MTT法考察了22種常用藥用輔料對(duì)細(xì)胞活性的影響,確定細(xì)胞攝取試驗(yàn)中輔料的濃度梯度：進(jìn)而以PEPT1經(jīng)典底物Gly-Sar為探針?biāo)幬?利用HPLC-MS/MS法測(cè)定藥物在細(xì)胞破碎液中的含量,計(jì)算細(xì)胞攝取率(Uptake ratio, UR)評(píng)價(jià)藥用輔料對(duì)Caco-2細(xì)胞膜上PEPT1功能的影響。通過Western blot以及熒光實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定活性藥用輔料對(duì)Caco-2細(xì)胞中PEPT1蛋白表達(dá)量以及mRNA表達(dá)量的影響。運(yùn)用熒光探針從胞內(nèi)pH以及膜流動(dòng)性兩個(gè)方面考察了活性輔料對(duì)Caco-2細(xì)胞中PEPT1影響的作用機(jī)制。為了進(jìn)一步驗(yàn)證篩選出的活性藥用輔料對(duì)PEPT1底物藥物口服吸收的影響,本文采用福辛普利鈉為探針?biāo)幬?用HPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定大鼠體內(nèi)原藥以及活性代謝物福辛普利拉的濃度,考察RH40、EL35、PEG400、吐溫20以及吐溫80對(duì)PEPT1轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響,并采用蛋白印跡法測(cè)定大鼠小腸各段PEPT1蛋白表達(dá)水平的變化。 結(jié)果：細(xì)胞攝取試驗(yàn)結(jié)果表明加入EL35、RH40、PEG400、PEG6000、 Eudragit L100、Eudragit L100-55、Eudragit RL PO、HPMC E30、吐溫20、吐溫80. CMC-Na. CMS-Na以及殼聚糖,可顯著影響Gly-Sar的細(xì)胞攝取量,推測(cè)這些輔料對(duì)PEPT1的功能有著不可忽視的作用。其余9種輔料(泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、PEG800. PEG1500、PEG4000、PVP K30、環(huán)糊精、TranscutolP、微晶纖維素)對(duì)探針二肽的攝取量無顯著性影響。Western blot結(jié)果表明PEG400、CMS-Na、EL35、RH40.吐溫20、吐溫80、Eudragit L100以及EudragitL100-55均可增加PEPT1膜蛋白的含量,而活性藥用輔料并不能顯著誘導(dǎo)或抑制PEPT1基因的表達(dá),推測(cè)蛋白水平的增加主要是由于胞質(zhì)內(nèi)的PEPT1向細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)移和嵌入的結(jié)果。部分活性藥用輔料可在一定程度上降低胞內(nèi)pH值,影響程度依次為吐溫20EL35吐溫80PEG400≈RH40。此外,PEG6000、殼聚糖、CMS-Na以及Eudragit L100可以減低孵育液的pH值,推測(cè)細(xì)胞內(nèi)外的氫離子濃度梯度差增加可能是上述9種輔料促進(jìn)PEPT1底物藥物攝取的原因之一。膜流動(dòng)性結(jié)果表明PEG400、EL35、RH40、吐溫20、吐溫80均可增加Caco-2細(xì)胞的膜流動(dòng)性。因此,輔料PEG400、EL35、RH40、吐溫20、吐溫80的顯著促PEPT1轉(zhuǎn)運(yùn)作用與細(xì)胞膜上蛋白含量增加、細(xì)胞內(nèi)外氫離子濃度梯度增大以及細(xì)胞膜流動(dòng)性增加相關(guān)。大鼠藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)結(jié)果顯示,PEG400、RH40、EL35、吐溫20及吐溫80各個(gè)輔料組福辛普利鈉的相對(duì)生物利用度分別為90.98%、725.27%、190.65%、240.00%和156.17%,代謝物福辛普利拉的相對(duì)生物利用度分別為171.25%、207.33%、253.33%、253.76%、200.05%。灌胃給予上述5種活性輔料24h后,各個(gè)輔料對(duì)大鼠十二指腸PEPT1蛋白表達(dá)豐度沒有顯著影響,對(duì)空腸和回腸PEPT1蛋白表達(dá)均表現(xiàn)出一定的下調(diào)作用,提示上述輔料確實(shí)可以通過影響腸道PEPT1轉(zhuǎn)運(yùn)功能促進(jìn)底物藥物的吸收。 結(jié)論：綜上所述,本文通過考察22種藥用輔料在Caco-2細(xì)胞模型中促進(jìn)PEPT1轉(zhuǎn)運(yùn)的作用,篩選出14種輔料進(jìn)一步進(jìn)行PEPT1促吸收作用機(jī)制研究,最后在整體動(dòng)物水平選取5種具有顯著促進(jìn)PEPT1作用的活性藥用輔料驗(yàn)證了其對(duì)底物的吸收促進(jìn)作用。研究結(jié)果顯示RH40、EL35等多種輔料均具有促進(jìn)PEPT1轉(zhuǎn)運(yùn)作用功能,可促進(jìn)底物藥物的吸收,提高藥物的口服生物利用度;上述藥用輔料對(duì)PEPT1功能的影響與促進(jìn)PEPT1蛋白向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移、改變胞內(nèi)外氖離子濃度差以及改變膜流動(dòng)性等多方面作用有關(guān)。本文研究結(jié)果可為了解PEPT1底物藥物與輔料之間的相互作用、底物藥物的合理劑型設(shè)計(jì)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R96

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9 ;藥用輔料管理辦法(試行)(征求意見稿)[A];第三屆全國(guó)藥用新輔料與中藥制劑新技術(shù)應(yīng)用研討會(huì)會(huì)議論文資料[C];2006年

10 侯世祥;;中藥制劑研究中的藥用輔料及其應(yīng)用技術(shù)[A];首屆全國(guó)藥用新輔料與中藥制劑新技術(shù)應(yīng)用研討會(huì)資料匯編[C];2004年

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7 行云;“藥用輔料”豈成“肇事”元兇？[N];中華工商時(shí)報(bào);2006年

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9 本報(bào)記者 劉云濤;我國(guó)中藥藥用輔料研究期待加速[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2007年

10 王華鋒;藥用輔料監(jiān)管體系日臻完善[N];中國(guó)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報(bào);2008年

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4 劉竹;我國(guó)藥用輔料管理現(xiàn)狀及對(duì)策研究[D];成都中醫(yī)藥大學(xué);2014年

5 夏軍平;國(guó)內(nèi)外藥用輔料管理的比較、我國(guó)藥用輔料現(xiàn)狀的分析及對(duì)策研究[D];四川大學(xué);2005年

6 栗穎;離子交換樹脂中國(guó)藥用輔料市場(chǎng)的推廣研究[D];上海交通大學(xué);2007年

7 王欣;藥用輔料生產(chǎn)企業(yè)第三方審計(jì)實(shí)施要點(diǎn)分析[D];成都中醫(yī)藥大學(xué);2013年

8 錢小峰;藥用輔料拉曼光譜庫(kù)構(gòu)建及其初步應(yīng)用[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2014年

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本文編號(hào)：2527440