發(fā)布時間：2019-06-28 09:02

【摘要】：結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的嚴(yán)重危害人類健康的傳染性疾病。全世界約有三分之一的人感染結(jié)核分枝桿菌。在2014年結(jié)核病導(dǎo)致約150萬人死亡。雖然近兩年有新的抗結(jié)核藥物上市,但已有耐藥菌株出現(xiàn)的報道。因此仍然急需開發(fā)新機制的高效低毒的抗結(jié)核藥物。氨酰-tRNA合成酶(AaRS)邑夠?qū)被岷蛯?yīng)的tRNA合成氨酰-tRNA (aa-tRNA),在蛋白質(zhì)生物合成中起著至關(guān)重要的作用。酪氨酰-tRNA合成酶(TyrRS)是該家族中的一員,阻斷其功能就能抑制病原菌的生長繁殖。結(jié)核中的TyrRS蛋白與人體內(nèi)的同源蛋白結(jié)構(gòu)差異巨大,因此針對該靶點可能發(fā)現(xiàn)新的低毒高效的抗結(jié)核化合物。本研究中我們利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng),在體外表達(dá)純化了具有良好催化活性的結(jié)核TyrRS蛋白。在此基礎(chǔ)上,利用同位素方法建立了酶抑制劑篩選模型。同時使用結(jié)核分枝桿菌的近緣菌株恥垢分枝桿菌作為檢定菌建立了表型篩選體系。聯(lián)用兩種方法對本實驗室保存的10萬個化合物進(jìn)行了篩選,最終發(fā)現(xiàn)了一個同時具有酶抑制活性和抗結(jié)核活性的化合物IMB-T130。測定了該化合物對結(jié)核分枝桿菌的抑制活性,發(fā)現(xiàn)它對結(jié)核標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv具有良好的抑制作用,MIC為0.08 μg／mL。特別的是它對臨床分離的耐藥菌株表現(xiàn)出良好的抑制活性,強于一線抗結(jié)核藥物異煙肼和利福平。我們通過表面等離子共振(SPR)實驗在分子水平證明了化合物和TyrRS蛋白之間存在相互作用。進(jìn)一步構(gòu)建了TyrRS蛋白過表達(dá)的恥垢分枝桿菌菌株,發(fā)現(xiàn)對化合物敏感性降低,在細(xì)胞水平驗證了化合物的靶向抑制作用。通過計算機軟件進(jìn)行分子對接,我們分析了化合物與蛋白的相互作用機制。進(jìn)一步對化合物細(xì)胞毒性,急性毒性和藥代動力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了檢測,結(jié)果顯示化合物毒性較小,具有良好成藥性。測定了化合物對于一系列革蘭氏陽性、陰性菌株的抗菌譜,結(jié)果顯示化合物對于結(jié)核分枝桿菌具有良好的選擇性。考慮到化合物對TyrRS酶抑制活性和體外抗菌活性之間存在一定差異,我們推測該化合物可能還作用于其他重要的抗結(jié)核靶標(biāo)。收集整理了已報道的結(jié)核分枝桿菌關(guān)鍵蛋白結(jié)構(gòu),通過計算機軟件與IMB-T130進(jìn)行分子對接,分析對接模型以尋找化合物新的作用靶標(biāo),我們推測莽草酸途徑中的3-脫氫奎尼酸合酶(DHQS)可能是IMB-T130發(fā)揮抗菌作用的另一靶標(biāo)。以此為基礎(chǔ),我們在體外表達(dá)純化了結(jié)核DHQS蛋白,通過孔雀綠定磷法檢測催化反應(yīng)中生成的游離磷酸,建立了酶活性測定體系,在酶水平驗證IMB-T130對該蛋白具有更強的抑制作用。SPR實驗結(jié)果進(jìn)一步證明了化合物和DHQS蛋白之間存在相互作用。通過高效液相技術(shù)對反應(yīng)底物測定,同樣證明陽性化合物確實阻斷了催化反應(yīng)的發(fā)生。以上實驗結(jié)果初步證實DHQS蛋白可能是化合物IMB-T130抗結(jié)核機制中更為關(guān)鍵的靶標(biāo)蛋白。本研究首次報道了化合物IMB-T130的抗結(jié)核分枝桿菌活性,它是第一個能夠有效抑制結(jié)核DHQS蛋白活性且同時具有優(yōu)秀抗結(jié)核作用的化合物。該化合物具有新的靶點與作用機制,與現(xiàn)有抗結(jié)核藥物不存在交叉耐藥,有可能發(fā)展成為新型抗結(jié)核先導(dǎo)化合物。
[Abstract]:Tuberculosis is an infectious disease that is seriously harmful to human health caused by Mycobacterium tuberculosis. About one third of the world's people are infected with Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis killed some 1.5 million people in 2014. Although new antituberculotic drugs have been listed in the last two years, there have been reports of drug-resistant strains. Therefore, it is still in urgent need of developing new mechanism's high-efficiency and low-toxic anti-tuberculosis drugs. The amino acid and the corresponding tRNA synthetic ammonia-tRNA (aa-tRNA) can play an important role in the biosynthesis of protein. TyrRS, a member of the family, can inhibit the growth and reproduction of pathogenic bacteria. The structural difference of the TyrRS protein in the tuberculosis and the homologous protein in the human body is great, so that the new low-toxicity and high-efficiency anti-tuberculosis compound can be found aiming at the target point. In this study we used the E. coli prokaryotic expression system to express and purify the TyrRS protein with good catalytic activity in vitro. On this basis, the enzyme inhibitor screening model was established by the isotope method. And a phenotype screening system is established by using the mycobacteria of the near-edge strain of the mycobacterium tuberculosis as a test bacterium. One hundred and ten thousand compounds stored in the laboratory were screened in combination with two methods, and a compound IMB-T130 with both an enzyme-inhibitory activity and an anti-tuberculosis activity was found. The inhibitory activity of the compound on the Mycobacterium tuberculosis was determined, and it was found to have a good inhibitory effect on the tuberculosis standard strain H37Rv, and the MIC was 0.08. mu.g/ mL. In particular, it has good inhibitory activity on the clinical isolated drug-resistant strains, and is stronger than that of the first-line anti-tuberculosis drugs and the rifampin. We demonstrated the interaction between the compound and the TyrRS protein at the molecular level by surface plasmon resonance (SPR) experiments. The strain of the Mycobacterium smegmatis that has been overexpressed by the TyrRS protein is further constructed, and the sensitivity of the compound is reduced, and the targeted inhibition effect of the compound is verified at the cell level. The interaction between the compound and the protein is analyzed by means of computer software for molecular docking. The toxicity, the acute toxicity and the pharmacokinetic properties of the compound are further detected, and the result shows that the compound has small toxicity and good drug property. The antibacterial spectrum of the compound for a series of Gram-positive and negative strains was determined, and the results showed that the compound has good selectivity for Mycobacterium tuberculosis. Considering that the compound has a certain difference in the inhibition activity of TyrRS and the in vitro antibacterial activity, we assume that the compound may also act on other important anti-tuberculosis targets. The key protein structure of the reported Mycobacterium tuberculosis is collected and arranged, the molecular docking is carried out by the computer software and the IMB-T130, and the butt-joint model is analyzed to find a new action target of the compound. We have speculated that the 3-dehydroquinic acid synthase (DHQS) in the shikimic acid pathway may be another target for IMB-T130 to play an antibacterial role. On the basis of this, we expressed the purified tuberculosis DHQS protein in vitro, and the free phosphoric acid produced in the catalytic reaction was detected by the malachite green method. The enzyme activity determination system was established, and the inhibition of IMB-T130 on the protein was demonstrated at the enzyme level. The SPR experimental results further demonstrated the interaction between the compound and the DHQS protein. The reaction substrate was determined by high-performance liquid-phase technology, and it was also proved that the positive compound did block the occurrence of the catalytic reaction. The above experimental results confirm that the DHQS protein may be a more critical target protein in the anti-tuberculosis mechanism of the compound IMB-T130. In this study, the activity of the compound IMB-T130 is reported for the first time, and it is the first compound capable of effectively inhibiting the activity of the tuberculosis DHQS protein and having excellent anti-tuberculosis effect. The compound has novel target and action mechanism, does not have cross resistance with the existing anti-tuberculosis drugs, and can be developed into a novel anti-tuberculosis lead compound.
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R966

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本文編號：2507173