【摘要】：糖尿病(DM)是全球范圍內(nèi)增長速度最快和發(fā)病率最為廣泛的疾病之一,近年來,以腸促胰島素為作用靶點的抗糖尿病藥物—二肽基肽酶Ⅳ (DPP-Ⅳ)抑制劑的研究備受關(guān)注。從食物蛋白中尋找天然、無副作用且功能多樣的DPP-Ⅳ抑制活性多肽類物質(zhì),是解決DPP-Ⅳ抑制藥物副作用的一個重要突破口。本文以牛和羊乳酪蛋白(CN)為研究對象,首先采用生物信息學(xué)方法預(yù)測了兩種不同來源酪蛋白中潛在DPP-Ⅳ抑制序列及生物活性潛能,再采用生物酶水解技術(shù)制備乳酪蛋白多肽驗證兩物種間真實的DPP-Ⅳ抑制活性及組成特性差異,然后將蛋白水解物經(jīng)超濾、二維硅膠薄層色譜或反相高效液相色譜、液質(zhì)聯(lián)用等手段分離并鑒定出其所含有效活性肽序列；在此基礎(chǔ)上,應(yīng)用酶動力學(xué)、分子模擬等技術(shù)手段闡述了DPP-Ⅳ抑制多肽的抑制特性及抑制機理,并探討了乳酪蛋白DPP-Ⅳ抑制肽對胃腸消化吸收的耐受性及對胰島細(xì)胞的功能。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：(1)采用生物信息學(xué)方法預(yù)測比較了牛、羊乳兩種不同來源酪蛋白中潛在的DPP-Ⅳ抑制序列及其生物活性潛能。牛、羊乳四種酪蛋白的一級氨基酸序列中均含多個DPP-Ⅳ抑制片段,羊乳酪蛋白中DPP-Ⅳ抑制肽在各酪蛋白組分中出現(xiàn)的概率PC值為κ-CN β-CN αs1-CN αs2-CN,對應(yīng)牛乳的PC值為β-CN κ-CN αs1-CN αs2-CN;而對于抑制潛能PI值,羊乳酪蛋白的PI值為κ-CN β-CN αs1-CN αs2-CN,對應(yīng)牛乳PI值為k-CN αs1-CNβ-CN βαs2-CN�？偫业鞍譊PP-IV抑制潛能PIΦ綜合考慮了四種酪蛋白在牛、羊乳中組成比例及各自PI值的差異,無論來自于高(PIΦ,8.04 10-6 μM-1g-1)還是低(PIΦ,8.25 10-6μM-1g-1) αs1-CN基因品種的羊乳PIΦ都比牛乳(PIΦ,7.7310-6 μM-1g-1)具有微弱的DPP-Ⅳ抑制潛能優(yōu)勢。另外,通過胰蛋白酶模擬水解羊乳酪蛋白,從其釋放的肽片段中篩選出兩條具有良好DPP-Ⅳ抑制活性的序列GPFPILV和HPINHR,IC50分別達(dá)163.7和452.2μM。(2)應(yīng)用5種商業(yè)蛋白酶分別水解牛、羊乳酪蛋白制備活性多肽,比較研究各種蛋白酶酶解物的體外DPP-Ⅳ抑制活性及組成特性差異。結(jié)果表明,牛、羊乳原始酪蛋白均沒有DPP-Ⅳ抑制能力,酶解產(chǎn)物卻具有顯著不同的DPP-Ⅳ抑制活性,DPP-Ⅳ抑制活性和水解度之間沒有直接對應(yīng)關(guān)系。羊乳酪蛋白比牛乳具有更好的蛋白酶消化特性,其制備所得大部分酶解物的DPP-Ⅳ抑制活性也優(yōu)于牛乳。篩選出胰蛋白酶作為水解�；蜓蛉槔业鞍字苽銬PP-Ⅳ抑制多肽的最佳用酶,最佳水解時間為3 h。雙酶聯(lián)合酶解并沒有顯著提高羊乳酪蛋白水解物的生物活性。羊乳酪蛋白胰蛋白酶水解物比牛乳具有更低的IC50值(羊0.801 mg/mL vs牛0.887 mg/mL),其5kDa比5 kDa超濾組分具有更強DPP-IV抑制活性,雖各組分均表現(xiàn)為競爭/非競爭混合型DPP-IV抑制方式,然而其抑制特點和抑制常數(shù)Ki值有顯著不同。(3)針對乳酪蛋白水解物的超濾組分,采用硅膠薄層色譜和/或高效液相色譜等技術(shù)進(jìn)一步分離,其中高活性子組分再通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒定所含肽序列。首次利用二維薄層色譜(第一維和第二維薄層展開劑分別為氯仿：甲醇：25%氨水(2：2：1)和正丁醇：乙酸：水(4：1：1))或一維薄層色譜(薄層展開劑為氯仿：甲醇：25%氨水(2：2：1))/高效液相色譜聯(lián)用的方法分離、分析蛋白功能水解物中的活性組分,其具有良好的蛋白水解物適用性,并且和后續(xù)質(zhì)譜鑒定技術(shù)能夠匹配和銜接。LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定出MHQPPQPL, SPTVMFPPQSVL, INNQFLPYPY和YPVEPF四條高效的乳酪蛋白源DPP-IV抑制新序列,特別是INNQFLPYPY的IC50達(dá)40.08μM。(4)對分析和鑒定出的有效DPP- Ⅳ抑制肽的抑制特性及抑制機理做了進(jìn)一步研究。酶抑制動力學(xué)分析表明鑒定出的食源蛋白DPP-Ⅳ抑制肽表現(xiàn)出反競爭抑制、非競爭抑制、競爭抑制、競爭/非競爭混合抑制多種抑制模式;反競爭或非競爭抑制肽具有良好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,可看作為DPP-Ⅳ酶的真正抑制劑,而含有第二位Pro的競爭或競爭/非競爭混合抑制肽則可被不等程度降解。分子模擬數(shù)據(jù)顯示這些肽會主要通過氫鍵和疏水相互作用方式結(jié)合在DPP-Ⅳ酶的不同氨基酸位點上。另外,這些DPP-Ⅳ抑制肽之間共存時對DPP-Ⅳ具有明顯的相互影響作用,且與抑制肽濃度相關(guān),并且對豬和人兩種不同生物來源DPP-Ⅳ酶具有不一致的敏感性和抑制特性,但整體對豬源DPP-Ⅳ酶的抑制活性值要顯著高于人源DPP-Ⅳ。(5)探討了牛、羊乳酪蛋白DPP-Ⅳ抑制肽對胃腸消化吸收后的耐受和穩(wěn)定性以及對胰島細(xì)胞的功能。經(jīng)胃腸模擬消化后,牛、羊乳酪蛋白酶解產(chǎn)物的DPP-Ⅳ抑制活性基本維持穩(wěn)定；其中所含有效序列MHQPPQPL、HPINHR和YPVEPF不存在消化道酶酶切位點,而INNQFLPYPY和GPFPILV則顯示出不穩(wěn)定的抗消化道酶水解能力。小腸上皮細(xì)胞對活性肽INNQFLPYPY、 INNQF和MHQPPQPL有完全不同的攝入能力和吸收速度。另外,牛、羊乳酪蛋白水解物對胰島β-細(xì)胞有明顯增殖作用,但在兩物種間沒有顯著差異；然而,牛乳酪蛋白水解物對β-細(xì)胞的促胰島素分泌作用顯著強于羊乳對應(yīng)物。
[Abstract]:Diabetes mellitus (DM) is one of the most rapidly growing and most prevalent diseases in the world. In recent years, the study of the anti-diabetic drug dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV) inhibitor targeting insulin as a target is of great concern. It is an important breakthrough to solve the side effects of DPP-IV. In this paper, we use the bioinformatics method to predict the potential DPP-鈪，

本文編號：2503544