【摘要】：膠質(zhì)瘤是一種常見(jiàn)且高致死率的原發(fā)性腦腫瘤,在小孩和成人中皆可發(fā)生。膠質(zhì)瘤患者經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)治療后,中位生存期只有13-16個(gè)月,并且超過(guò)70%的膠質(zhì)瘤患者在確診后的2年內(nèi)死亡。為了提高膠質(zhì)瘤治療的有效性及改善膠質(zhì)瘤患者的存活狀況,開(kāi)發(fā)出新的安全有效的治療藥物顯得尤為重要。N25(注:N25化學(xué)名:N-(2,5-二甲氧基苯基)-N`-羥基辛二酰胺,專(zhuān)利授權(quán)號(hào):ZL201310087797.9),一種新型的組蛋白去乙酰化酶抑制劑,我們?cè)赟AHA的基礎(chǔ)上進(jìn)行構(gòu)效修飾而獲得。細(xì)胞自噬,又稱(chēng)Ⅱ型細(xì)胞死亡,是指細(xì)胞將自生胞漿蛋白或細(xì)胞器包裹形成囊泡,并與溶酶體融合形成自噬溶酶體進(jìn)而降解自身成分的過(guò)程。細(xì)胞自噬在腫瘤中發(fā)揮著重要作用,其與腫瘤的關(guān)系十分復(fù)雜,目前尚未完全闡明。為了研究N25的抗腫瘤作用及其誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬的分子機(jī)制,我們進(jìn)行了系列相關(guān)實(shí)驗(yàn)。首先,我們使用CCK-8法檢測(cè)了N25的體外抗增殖活性,并通過(guò)建立裸鼠膠質(zhì)瘤移植模型評(píng)價(jià)N25的體內(nèi)抗腫瘤作用;然后,我們通過(guò)透射電子顯微鏡觀察了N25是否誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬;此外,我們隨機(jī)收集了20例臨床膠質(zhì)瘤樣本及3例正常腦組織,通過(guò)western blot分析了臨床膠質(zhì)瘤樣本中LC3,HDAC3,Tip60等蛋白的表達(dá)情況;最后,我們用western blot分析了N25對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中HDAC3,Tip60,ULK1(Atg1),Beclin-1(Atg6)等蛋白的影響,并檢測(cè)了選擇性HDAC3抑制劑RGFP966是否誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬。我們的研究結(jié)果顯示,N25的體外抗增殖活性略強(qiáng)于SAHA,通過(guò)計(jì)算得出N25與SAHA的IC50分別為2.55μM和3.58μM,并且從繪制的生長(zhǎng)抑制曲線可以發(fā)現(xiàn),在相對(duì)較低濃度范圍內(nèi),N25較SAHA能夠更顯著地抑制膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的生長(zhǎng);在膠質(zhì)瘤移植模型中也發(fā)現(xiàn),N25具有顯著的體內(nèi)抗腫瘤活性且略強(qiáng)于SAHA,其中,N25高劑量組(96 mg/kg)對(duì)膠質(zhì)瘤移植模型的抑瘤率約為68%。在透射電子顯微鏡的觀察中,我們發(fā)現(xiàn)N25(5μM)可以明顯誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬體的產(chǎn)生。在對(duì)臨床膠質(zhì)瘤樣本的分析中,我們發(fā)現(xiàn),與正常腦組織相比,HDAC3是明顯上調(diào)的,而LC3與Tip60是明顯下調(diào)的。當(dāng)我們用N25處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)HDAC3明顯受到抑制,而LC3與Tip60明顯增加。此外,我們也發(fā)現(xiàn)N25明顯誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中ULK1(Atg1),Beclin-1(Atg6)等自噬相關(guān)蛋白的表達(dá),并且發(fā)現(xiàn)選擇性HDAC3抑制劑RGFP966也可明顯誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬�？傊�,這些數(shù)據(jù)表明N25具有顯著的抗腫瘤活性,且部分原因可能與HDAC3的抑制有關(guān);此外,N25可能通過(guò)一條新的通路誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬,即N25通過(guò)下調(diào)HDAC3,激活Tip60,進(jìn)而刺激ULK1和Beclin-1而誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬。
[Abstract]:Glioma is a common and lethal primary brain tumor, which can occur in both children and adults. After standard treatment, the median survival time of glioma patients was only 13 脳 16 months, and more than 70% of glioma patients died within 2 years after diagnosis. In order to improve the efficacy of glioma treatment and improve the survival of glioma patients, it is particularly important to develop new safe and effective therapeutic drugs. N25 (N25 chemical name: N25 (2, 5-dimethoxyphenyl)-N`hydroxyoctanediamide, patent authorization number: ZL201310087797.9), a new histone deacetylase inhibitor, we obtained on the basis of SAHA structure-activity modification. Autophagy, also known as type II cell death, refers to the process in which cells encapsulate authigenic cytoplasmic proteins or organelle to form vesicles and fuse with lysosomes to form autophagy lysosomes and then degrade their own components. Autophagy plays an important role in tumor, and the relationship between autophagy and tumor is very complex, which has not been fully clarified at present. In order to study the antitumor effect of N25 and the molecular mechanism of inducing autophagy of glioma cells, we carried out a series of related experiments. First, we detected the anti-proliferation activity of N25 in vitro by CCK-8 assay, and evaluated the antitumor effect of N25 in vivo by establishing a nude mice glioma transplantation model. Then, we observed whether N25 induced autophagy of glioma cells by transmission electron microscope. In addition, 20 clinical glioma samples and 3 normal brain tissues were randomly collected, and the expression of LC3,HDAC3,Tip60 and other proteins in clinical glioma samples was analyzed by western blot. Finally, we analyzed the effect of N25 on HDAC3,Tip60,ULK1 (Atg1), Beclin-1 (Atg6) and other proteins in glioma cells by western blot, and detected whether RGFP966, a selective HDAC3 inhibitor, induced autophagy of glioma cells. Our results show that the anti-proliferation activity of N25 in vitro is slightly stronger than that of SAHA,. The IC50 of N25 and SAHA are 2.55 渭 M and 3.58 渭 M, respectively. From the drawn growth inhibition curve, it can be found that N25 can inhibit the growth of glioma U87 cells more significantly than SAHA in a relatively low concentration range. It was also found that N25 had significant antitumor activity in vivo and was slightly stronger than SAHA, in glioma transplantation model. The tumor inhibition rate of N25 high dose group (96 mg/kg) was about 68%. In the observation of transmission electron microscope, we found that N25 (5 渭 M) could obviously induce the production of autophagy in glioma cells. In the analysis of clinical glioma samples, we found that compared with normal brain tissue, HDAC3 was significantly up-regulated, while LC3 and Tip60 were significantly down-regulated. When we treated glioma cells with N25, it was found that HDAC3 was significantly inhibited, while LC3 and Tip60 were significantly increased. In addition, we also found that N25 significantly induced the expression of ULK1 (Atg1), Beclin-1 (Atg6) and other autophagy related proteins in glioma cells, and found that selective HDAC3 inhibitor RGFP966 could also induce autophagy in glioma cells. In conclusion, these data suggest that N25 has significant antitumor activity, and some of the reasons may be related to the inhibition of HDAC3. In addition, N25 may induce autophagy of glioma cells through a new pathway, that is, N25 can induce autophagy of glioma cells by down-regulating HDAC3, to activate Tip60, and stimulating ULK1 and Beclin-1.
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R96

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本文編號(hào)：2501225