發(fā)布時間：2019-06-14 23:28

【摘要】：丙戊酸鈉(VPA)是目前在世界范圍內使用最廣泛的一線抗驚厥藥物和定期用于偏頭痛治療、雙相性精神障礙和慢性頭痛的治療藥物,并且經常也會拿來作為輔助的化療,但是VPA的使用會造成嚴重肝損傷的副作用。Alpers綜合征(AHS),是一種由于線粒體DNA聚合酶POLG基因突變造成的遺傳性線粒體遺傳性疾病。Alpers綜合征最顯著的一個肝病特征是對于在幼兒時期發(fā)生的VPA誘導的肝毒性具有很高的風險。然而,這種高風險的肝毒性發(fā)生的機制是什么一直還不清楚,因此本文試圖利用體外分化建立的疾病模型來探索其中的原因。在本研究中,我們將兩例AHS病人的成纖維細胞誘導成為病人特異性的誘導多能性細胞,然后在用無血清體系下將它們的多能干細胞分化成病人來源特異性肝細胞(AHS iPSCs-Hep)。兩個病人的分化的肝細胞與正常的對照細胞相比,都對VPA誘導的肝毒性非常敏感,產生凋亡。并且,細胞凋亡是依賴線粒體途徑的,因為凋亡蛋白caspase-9和caspase-3都被激活,而且細胞色素c也被釋放出來。與此同時,值得注意的是,AHS病人肝細胞中線粒體內保持線粒體嵴緊密和保護細胞色素c不被釋放出來的OPA1復合物的量也比正常對照的要少。進一步研究發(fā)現(xiàn),AHS病人肝細胞的線粒體DNA聚合酶POLG的表達量和線粒體DNA的含量比正常對照細胞的都要少,而且,AHS病人肝細胞ATP的產生能力也較正常對照的要弱。AHS iPSCs分化得到肝細胞AHS iPSCs-Hep其線粒體的結構也不正常,嵴變得少兒膨大,甚至有些線粒體缺少嵴。在研究VPA誘導AHS iPSCs-Hep凋亡敏感性機制時,我們發(fā)現(xiàn),一種由于線粒體超氧化物的量瞬時增加而產生的超氧炫,其產生的頻率比正常對照細胞要高,而這種超氧炫的產生本質上是由線粒體通透性轉換孔(mPTP)的開放引起的。同時,當我們加入mPTP抑制劑時,AHS iPSCs-Hep對于VPA誘導的肝毒性的敏感性下降到正常對照的水平。本研究的這些結果說明如果把線粒體mPTP作為藥物靶點設計藥物,很有可能會防止AHS病人對于VPA誘導的肝毒性的發(fā)生。此外,曾報道過用于治療VPA誘導的肝毒性的藥物乙酰膽堿carnitine和N-acetylcysteine (NAC),在本研究的疾病模型中同樣可以降低AHS病人對VPA誘導的肝毒性的敏感性。總之通過AHS病人成纖維細胞來源的iPSCs建立的AHS病人的肝疾病模型的研究,揭示了AHS病人肝細胞對VPA誘導的肝毒性的機制,證明其是因為AHS病人肝細胞線粒體mPTP的開放引發(fā)的依賴線粒體途徑的細胞凋亡。本研究是首次使用iPSCs建立的遺傳性線粒體疾病的毒理學模型,這一模型可以為篩選治療藥物提供新的評估方法。
[Abstract]:Sodium valproate (VPA) is currently the most widely used first-line anticonvulsant in the world and regularly used in migraine treatment, biphasic mental disorder and chronic headache, and is often used as an auxiliary chemotherapy, but the use of VPA can cause side effects of severe liver injury. Alpers syndrome (AHS), One of the most significant characteristics of liver disease in Alpers syndrome is that it has a high risk for VPA-induced hepatotoxicity in early childhood. However, it has not been clear what the mechanism of this high risk hepatotoxicity is, so this paper attempts to explore the causes by using the disease model established by differentiation in vitro. In this study, the fibroblasts of two patients with AHS were induced into patient-specific induced pluripotency cells, and then their pluripotent stem cells were differentiated into patient-specific hepatocytes (AHS iPSCs-Hep) in a serum-free system. Compared with the normal control cells, the differentiated hepatocytes of both patients were very sensitive to VPA-induced hepatotoxicity and produced apoptosis. Moreover, apoptosis depends on the mitochondrial pathway because both apoptosis proteins caspase-9 and caspase-3 are activated and cytochrome c is released. At the same time, it is worth noting that the amount of OPA1 complex in the hepatocytes of AHS patients that keeps the crest of mitochondria tight and protects the release of cytochrome c from release is also less than that of the normal control group. It was found that the expression of DNA polymerase POLG and the content of mitochondrial DNA in hepatocytes of AHS patients were lower than those of normal control cells, and the production ability of ATP in hepatocytes of AHS patients was weaker than that of normal controls. The structure of hepatocytes AHS iPSCs-Hep was not normal, and the cristae became enlarged in children, and even some mitochondria lacked cristae. In studying the sensitivity mechanism of AHS iPSCs-Hep apoptosis induced by VPA, we found that a kind of hyperoxia produced by the instantaneous increase of the amount of mtDNA superoxide produced higher frequency than that of normal control cells, and the production of this type of hyperoxia was essentially caused by the opening of (mPTP) in the permeability transition pore of mitochondria. At the same time, when we added mPTP inhibitor, the sensitivity of AHS iPSCs-Hep to VPA-induced hepatotoxicity decreased to the level of normal control. These results suggest that if mtmPTP is used as a drug target to design drugs, it is possible to prevent the hepatotoxicity induced by VPA in AHS patients. In addition, it has been reported that acetylcholine carnitine and N-acetylcysteine (NAC), which are used to treat VPA-induced hepatotoxicity, can also reduce the sensitivity of AHS patients to VPA-induced hepatotoxicity in the disease model of this study. In a word, the liver disease model of AHS patients established by iPSCs from fibroblasts of AHS patients revealed the mechanism of hepatotoxicity induced by VPA in AHS patients, which proved that the mechanism of hepatotoxicity induced by VPA in AHS patients was due to the apoptosis induced by the opening of mitochondrial mPTP in AHS patients. This study is the first time that iPSCs has been used to establish a toxicological model of hereditary mitochondrial disease, which can provide a new evaluation method for screening therapeutic drugs.
【學位授予單位】：中國科學技術大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R96

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本文編號：2499790