【摘要】：由ABC(ATP-binding cassette)轉運蛋白家族的多藥耐藥蛋白P-glycoprotein(P-gp)介導的藥物外排是引發(fā)腫瘤細胞多藥耐藥(Multidrug resistance,MDR)的重要原因。抑制P-gp的藥物外排功能已成為當前臨床克服MDR的重要策略之一。因此,P-gp底物和抑制劑的結合模式與作用機理研究對于探索腫瘤細胞耐藥機制以及抗腫瘤藥物研發(fā)具有重要的理論意義和應用價值。迄今為止,由于缺乏人類P-gp蛋白的三維結構及實驗技術手段的制約,其底物結合模式與轉運機理仍然未知。論文采用定量構效關系(Quantitative structure-activity relationship,QSAR)、分子對接(Molecular docking)和分子動力學(Molecular dynamics,MD)模擬等計算生物學理論與方法,對P-gp底物和抑制劑的分子識別、結合模式、結合通路以及作用機理進行了系統(tǒng)研究,并取得了階段性研究成果,主要包括:(1)采用顯露化學模式(Emerging chemical patterns,ECP)以及聚合顯露模式分類算法(Classification by aggregating emerging patterns,CAEP)建立了P-gp底物分子識別模型。研究結果顯示:最優(yōu)ECP模型對803個訓練集樣本、120個測試集樣本和179個獨立的外部驗證集樣本的預測準確度分別達到了0.80、0.81和0.74。最優(yōu)模型僅涉及3個關鍵的分子結構信息,其預測準確性和可解釋性均優(yōu)于已有模型。對P-gp底物18個ECP的聚類分析得到2組ECP集合(ECP group,ECPG),即ECPG1和ECPG2。結合部分底物的結合位點信息,發(fā)現(xiàn)具有ECPG1模式特征的底物傾向結合H位點,而具有ECPG2模式特征的底物傾向結合R位點。因此,論文所建ECP模型既可以識別底物分子,同時還可根據(jù)分子的ECP特征推測底物可能的結合位點。(2)采用ECP和CAEP分類算法建立了P-gp抑制劑分子識別模型。從857個訓練集樣本中選取7個抑制劑和27個非抑制劑樣本,并基于3個關鍵的分子結構特征建立了最優(yōu)ECP模型。研究結果顯示:最優(yōu)模型對857個訓練集樣本和418個測試集樣本的預測準確度分別為0.80和0.86;對2個獨立的外部驗證集的預測準確度則分別達到0.70和0.80。ECP特征分析發(fā)現(xiàn):1)HTv(H total index weighted by atomic van der Waals volume)是區(qū)分P-gp抑制劑與非抑制劑的重要分子特征;2)多數(shù)抑制劑分子傾向與底物的H位點發(fā)生結合。比較研究發(fā)現(xiàn):P-gp底物和抑制劑在m Log P(Moriguchi octanol-water partition coefficient)、t PSA(Total polar accessible surface area)和n Hacc(The number of H-bond acceptors)3個分子性質的分布上具有顯著性差異,上述差異可作為P-gp底物和抑制劑識別的重要特征。(3)基于2個空載狀態(tài)下的小鼠P-gp晶體結構(PDB ID:4M1M,4Q9H),采用Surflex-Dock方法對441個底物和666個抑制劑進行了分子對接研究。結果顯示:底物和抑制劑在對接得分上無顯著性差異,表明對接得分無法區(qū)分底物與抑制劑。相比之下,抑制劑傾向與疏水性氨基酸殘基發(fā)生非特異性相互作用,而底物則更傾向與極性氨基酸殘基發(fā)生特異性靜電作用。與此同時,對于同一種受體構象,P-gp底物和抑制劑的結合位點基本相同。此外,利用已知結合位點的8個P-gp底物,論文對2種構象下H和R位點的空間位置進行比較分析。結果表明:對于2種P-gp受體構象,H和R位點的位置有明顯差異。以上研究證實,由于空載狀態(tài)下P-gp構象具較大柔性,P-gp可能包含多個H和R位點。(4)應用PNEB(Partial nudged elastic band)模擬方法對P-gp底物和抑制劑的結合通路進行了研究。結果表明:位于磷脂雙分子層的底物和抑制劑,可經(jīng)由TM4和TM6形成的通道進入P-gp結合空腔。MM/GBSA結合自由能分析表明,底物Rhodamine-123和抑制劑QZ-Leu從磷脂雙分子層進入結合空腔是一個自發(fā)過程。動力學軌跡分析結果顯示:對于大體積的抑制劑QZ-Leu,TM4的構象發(fā)生了極為顯著的改變,表明TM4的結構柔性對大體積分子的結合具有重要的調控作用。同時,在底物Rhodamine-123和抑制劑QZ-Leu的結合過程中,位于TM6的Phe339側鏈均發(fā)生了明顯的旋轉,暗示Phe339可能對分子結合通路的打開或關閉具有重要的門控作用。(5)采用分子動力學模擬對P-gp底物和抑制劑的作用機理進行了研究。研究結果顯示:當結合底物Rhodamine-123時,位于2個ATP結合位點的保守氨基酸殘基(Lys和Ser)間的距離相對減小,暗示底物的結合可促使NBD1和NBD2相互靠近,有利于NBD的二聚化和ATP水解位點的形成。而抑制劑QZ-Leu的結合則導致NBD1和NBD2間的距離顯著增大,ATP結合位點更加開放。結果表明:底物和抑制劑的結合對NBDs的構象具有重要影響。MM/GBSA結合自由能計算結果表明,抑制劑QZ-Leu與P-gp的親和活性較底物Rhodamine-123更高,據(jù)此推測抑制劑的高親和活性對維持P-gp的NBDs的開放構象和抑制ATP水解活性有利;而底物相對的低親和活性則可能有利于后續(xù)的跨膜轉運過程�？偟膩碚f,論文的研究結果可為P-gp底物和抑制劑的虛擬篩選、相關抗腫瘤藥物研發(fā)以及P-gp底物和抑制劑的作用機理研究提供重要的參考依據(jù)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：重慶大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R96

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本文編號：2494820