【摘要】：芥子氣（Sulfur Mustard，SM）是糜爛性毒劑的典型代表，接觸可引起皮膚、眼睛、呼吸道等組織器官的急性損傷并遺留長期并發(fā)癥。皮膚接觸是芥子氣中毒的重要途徑，中毒早期病變包括紅斑、水皰、紫癜，隨著時間推移表現為色素沉著、皮膚干燥、瘙癢、脫屑和櫻桃狀血管瘤等，嚴重影響中毒者的生活質量。芥子氣毒理機制復雜，目前尚無特效藥問世。 芥子氣誘導的組織損傷與炎癥反應關系密切。損傷區(qū)域聚集的大量中性粒細胞、單核細胞以及巨噬細胞等可釋放髓過氧化物酶、炎性細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1、IL-8等，并誘導P物質、組織蛋白酶、纖溶酶原激活物、組胺等釋放，導致組織紅腫、水皰、壞死等病理損傷。芥子氣誘導的炎癥反應涉及多條信號通路，包括花生四烯酸代謝途徑、絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路、核轉錄因子-κB（Nuclear transcription factor-κB，NF-κB）信號通路等�；ㄉ南┧峥山洯h(huán)氧合酶和脂氧合酶催化產生前列腺素和白三烯。MAPK通路和NF-κB通路則可調節(jié)多種炎性介質的轉錄。以上述信號通路的關鍵信號分子為靶點的治療藥物研究一直是芥子氣損傷防治藥物研究的熱點和重要方向。 本研究針對芥子氣引起炎性損傷的不同環(huán)節(jié)，選擇了七大類抗炎和免疫抑制藥物，評價了它們對芥子氣所致皮膚損傷的保護作用，包括臨床常用的傳統(tǒng)抗炎藥甾體與非甾體抗炎藥，以及新型具有抗炎活性的藥物辣椒素受體激動劑、p38抑制劑、程序性壞死抑制劑、免疫抑制類藥物等，旨在明確不同種類抗炎藥物的抗芥子氣損傷活性及其藥效特點。在此基礎上，考察了以抗炎藥物為基礎的藥物聯用方案，為基于炎癥反應的抗芥子氣損傷藥物研究提供了可靠的實驗依據。 目的 考察不同類別抗炎/免疫抑制藥物及以抗炎藥物為基礎的藥物聯用方案對芥子氣所致皮膚損傷的保護作用。 方法 芥子氣小鼠耳郭染毒模型的建立：采用32和128mg/mL芥子氣5μL于雄性KM小鼠右耳內側皮膚染毒，染毒24h、48h后，采用直徑為8mm的打孔器取下耳郭標本，立即稱重，計算腫脹率，將標本置于4%甲醛溶液中固定，制備病理切片，觀察耳郭的組織病理學變化。 芥子氣全身中毒模型的建立：采用芥子氣40mg/kg于雄性BalB/c小鼠皮下注射染毒建立芥子氣全身中毒致死模型，每天給予相應藥物，觀察染毒7天內動物存活情況； 芥子氣染毒細胞損傷模型的建立：將人表皮角質形成細胞系HaCaT細胞于200、1000μM芥子氣染毒30min后，PBS洗細胞一次，加入相應藥物，繼續(xù)培養(yǎng)6、24h，采用ATP法檢測細胞活力，采用ELISA試劑盒測定細胞上清中IL-6和IL-8的含量； p38抑制劑系列化合物細胞水平篩選模型：采用1μg/mL LPS刺激小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞，加入相應藥物后繼續(xù)培養(yǎng)24h，采用AlphaLISA法檢測培養(yǎng)上清中TNF-α含量，MTT法檢測活細胞數； 芥子氣誘導p38和JNK激酶活化的時效關系考察： HaCaT細胞于200μM芥子氣染毒30min后，PBS洗細胞一次，繼續(xù)培養(yǎng)0、0.5、1、1.5、3、6、12、24h，采用Luminex技術檢測細胞裂解液中p-p38、t-p38、p-JNK和t-JNK的表達； p38抑制劑對芥子氣誘導p38和JNK激酶活化的影響： HaCaT細胞于200μM芥子氣染毒30min后，PBS洗細胞一次，加入20μM SB203580或BIRB796繼續(xù)培養(yǎng)0.5、12h，采用Luninex技術和Western Blotting檢測細胞裂解液中p-p38、t-p38、p-JNK和t-JNK的表達。 結果 一、甾體與非甾體抗炎藥物抗染毒皮膚損傷作用評價 甾體和非甾體類抗炎藥是目前臨床使用最為廣泛的抗炎藥物，對多種病因所致的多種炎性疾病有良好的治療效果。甾體類抗炎藥通過調控靶基因的轉錄從而調節(jié)炎性介質的產生，而非甾體類抗炎藥物主要通過抑制環(huán)氧合酶從而減少前列腺素的產生，降低機體炎癥反應。本研究在建立不同損傷程度的芥子氣耳郭皮膚染毒模型的基礎上，選擇甾體類抗炎藥物代表藥地塞米松和非甾體類抗炎藥代表藥吲哚美辛，考察了它們抗芥子氣損傷作用的藥效特點。 1.不同劑量芥子氣所致小鼠染毒耳郭皮膚損傷模型的建立 芥子氣所致皮膚損傷的嚴重程度與染毒劑量有關，染毒劑量越高，皮膚腫脹越明顯。本研究采用文獻中常用的32mg/mL芥子氣5μL（低劑量）和在溶劑中達最大溶解度，即128mg/mL，5μL（高劑量）兩個染毒劑量建立了不同損傷程度的芥子氣小鼠耳郭染毒皮膚損傷模型，腫脹率分別為154.7%和204.8%。 2.甾體類抗炎藥地塞米松對芥子氣耳郭染毒小鼠皮膚損傷的影響 染毒前30min灌胃給予甾體類抗炎藥物地塞米松（5mg/kg）對芥子氣染毒小鼠耳郭腫脹無影響。 3.非甾體類抗炎藥吲哚美辛抗芥子氣損傷的藥效評價 染毒前30min灌胃給予非甾體類抗炎藥吲哚美辛（10mg/kg）對高、低劑量芥子氣染毒小鼠耳郭腫脹均有顯著地抑制作用，腫脹抑制率分別是40.0%和25.7%。 二、新型具有抗炎活性藥物抗芥子氣損傷的藥效評價 芥子氣致傷機制復雜，涉及多種炎性反應環(huán)節(jié)，因此本研究還進一步針對芥子氣致炎的其它環(huán)節(jié)開展了研究。 1.辣椒素受體激動劑抗芥子氣損傷作用評價 辣椒素受體激動劑可通過耗竭P物質抑制炎癥反應，代表藥物為奧伐尼。臨床上用于減輕神經性炎癥以及鎮(zhèn)痛止癢等。目前僅有少量文獻報道，其減輕芥子氣所致皮膚損傷，但作用特點尚不明確。本研究以非甾體抗炎藥吲哚美辛為陽性對照，考察了奧伐尼對染毒皮膚損傷的影響。結果表明，局部涂抹給予奧伐尼（0.125、0.25和0.05mg/耳）對低劑量芥子氣染毒小鼠耳郭腫脹均有顯著地抑制作用，且強于吲哚美辛，腫脹抑制率分別是68.2%、87.0%和81.6%；奧伐尼對高劑量芥子氣染毒小鼠耳郭腫脹無明顯影響。 進一步采用伊紅-蘇木素染色，觀察奧伐尼對低劑量芥子氣染毒耳郭皮膚病理損傷的影響。結果表明，奧伐尼可顯著降低芥子氣誘導炎性細胞浸潤和表皮細胞壞死，且保護作用強于吲哚美辛。 2. p38抑制劑抗芥子氣損傷活性篩選與評價 p38激酶居于炎性反應的中央環(huán)節(jié)，其抑制劑是近年來抗炎免疫藥理學研究的熱點之一。BIRB796是第一個進入III期臨床試驗的p38抑制劑。本課題與化學合成實驗室合作，獲得了50個BIRB796類似物，并對它們的抗芥子氣損傷活性進行了篩選和評價。 2.1BIRB796類似物的抗炎活性初篩 采用LPS誘導小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞的體外模型，以p38抑制劑SB203580作為陽性對照，觀察了50個化合物的抗炎活性。結果表明，化合物p38-98、p38-99、p38-123細胞毒性低，且可顯著性抑制LPS誘導TNF-α分泌，IC50分別為10.33μM、48.92μM和19.39μM。 2.1.1p38抑制劑抗芥子氣損傷細胞水平藥效評價 2.1.1.1p38抑制劑對芥子氣染毒HaCaT細胞活力的影響 采用芥子氣染毒HaCaT細胞模型，觀察了p38抑制劑SB203580、BIRB796以及活性化合物p38-98、p38-99對染毒細胞的保護作用。結果表明，SB203580、BIRB796、p38-98、p38-99在染毒后6h時可顯著改善200μM芥子氣所致細胞活力的降低。 2.1.1.2p38抑制劑對芥子氣染毒HaCaT細胞IL-6和IL-8分泌的影響 采用芥子氣染毒HaCaT細胞模型，觀察了p38抑制劑SB203580、BIRB796以及活性化合物p38-98、p38-99對染毒細胞炎性介質分泌的影響。結果表明，SB203580、BIRB796、p38-98、p38-99均可顯著地抑制炎性細胞因子IL-6和趨化因子IL-8的分泌，并呈良好的劑量依賴關系。在兩種p38抑制劑代表化合物中，BIRB796抑制作用強于SB203580。 2.1.2p38抑制劑抗芥子氣損傷整體動物水平藥效評價 2.1.2.1p38抑制劑對芥子氣耳郭染毒小鼠皮膚損傷的影響 染毒前24h、30min以及染毒后12h腹腔注射給予SB203580、BIRB796以及活性化合物p38-98、p38-99（10mg/kg），考察了上述p38抑制劑對染毒皮膚損傷的影響。結果表明，除SB203580外，BIRB796、p38-98、p38-99對耳腫脹均有一定的抑制趨勢，抑制率分別是20.5%、17.4%和17.8%。 2.1.2.2p38抑制劑對芥子氣全身中毒小鼠存活的影響 采用芥子氣40mg/kg（LD99）進行皮下注射染毒建立芥子氣全身中毒模型，靜脈注射給予p38抑制劑SB203580、BIRB796以及活性化合物p38-98、p38-99（5mg/kg/d），觀察小鼠染毒7天內的死亡情況。結果表明，模型組小鼠于染毒第5天全部死亡，藥物處理組小鼠分別于染毒第6天和第7天全部死亡，提示p38抑制劑對全身中毒小鼠的存活率無明顯影響 2.1.2.3p38抑制劑中活性化合物代謝穩(wěn)定性研究 采用大鼠肝微粒體模型，對SB203580、BIRB796、p38-98、p38-99進行初步的代謝穩(wěn)定性分析。結果表明，p38-98在大鼠肝微粒體中孵育60min后原型剩余量達到50%。提示p38-98具有較好的代謝穩(wěn)定性。 2.1.3SB203580和BIRB796抗芥子氣損傷機制研究 從藥效評價結果可知，變構型p38抑制劑BIRB796對芥子氣炎性損傷的保護作用強于競爭性p38抑制劑SB203580。本研究從對應激活化蛋白激酶（stress-activated proteinkinases，SAPKs）c-Jun氨基末端激酶（c-Jun Nterminal kinase，JNK）與p38活性的影響的角度，對SB203580和BIRB796的抗炎機制進行了考察。 2.1.4芥子氣誘導染毒HaCaT細胞p38和JNK激酶活化 首先采用Luminex液相芯片技術，考察了芥子氣對HaCaT細胞p38與JNK磷酸化的影響。結果表明，芥子氣可迅速誘導p38和JNK激酶磷酸化水平升高，并在染毒后0.5h達到高峰。 2.1.5p38抑制劑對SM誘導p38和JNK激酶活化的影響 進而采用Luminex液相芯片技術和Western Blotting，檢測SB203580和BIRB796對染毒HaCaT細胞p38和JNK激酶磷酸化的影響。結果表明，BIRB796可同時抑制芥子氣誘導的p38和JNK激酶的磷酸化，而SB203580抑制p38激酶的磷酸化，卻引起JNK激酶磷酸化程度升高。 綜上可知，p38抑制劑對染毒細胞模型有顯著的保護作用，對染毒皮膚損傷有一定保護趨勢。相比SB203580，BIIRB796保護作用更明顯，這可能與BIRB796同時抑制芥子氣誘導的p38和JNK磷酸化，而SB203580抑制p38卻代償性引起JNK磷酸化升高有關。 3.程序性壞死抑制劑抗芥子氣損傷作用評價 程序性壞死是近年來發(fā)現的一種由死亡受體介導的caspases非依賴性細胞死亡模式，在凋亡被抑制的情況仍可介導細胞壞死，其在炎癥性病變、缺血性心腦血管病、神經退行性疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展及腫瘤細胞的耐藥方面具有重要意義。DNA烷基化損傷可誘導細胞程序性壞死。而關于程序性壞死是否參與了芥子氣誘導的細胞損傷目前尚無報道。本研究首次進行了程序性壞死抑制劑抗芥子氣損傷作用的研究。 3.1程序性壞死抑制劑對染毒HaCaT細胞存活的影響 采用芥子氣染毒HaCaT細胞模型，同時加入凋亡抑制劑z-VAD-fmk阻斷細胞凋亡，觀察程序性壞死抑制劑Nec-1對細胞存活的影響。結果表明，Nec-1、z-VAD-fmk單用時對芥子氣所致HaCat細胞死亡具有明顯保護作用，兩者合用時對細胞的保護作用明顯增強，細胞存活率接近100%。提示，程序性壞死參與芥子氣誘導細胞死亡。 3.2程序性壞死抑制劑對芥子氣染毒小鼠耳郭腫脹的影響 進一步，對程序性壞死抑制劑抗芥子氣所致皮膚損傷的作用進行評價。結果表明，染毒前腹腔注射給予Nec-1（4mg/kg）和z-VAD-fmk（10mg/kg）對染毒耳腫脹均無明顯影響。 4.免疫抑制劑抗芥子氣損傷的藥效評價 FTY720可通過降低外周血淋巴細胞數從而降低機體免疫反應，目前其治療腎移植排斥反應已進入Ⅲ期臨床研究階段，對類風濕性關節(jié)炎模型的改善作用也已取得初步療效。本研究采用小鼠芥子氣耳郭皮膚染毒模型，考察了S1P抑制劑FTY720對芥子氣染毒小鼠皮膚損傷的影響。結果表明，提前3天按1mg/kg/d連續(xù)灌胃給予FTY720對芥子氣染毒小鼠耳郭腫脹無明顯影響。 5.中藥制劑抗芥子氣損傷的藥效評價 七葉皂苷鈉具有抗炎抗?jié)B出的作用，，并可促進體內皮質醇類化合物的分泌。結果表明，七葉皂苷鈉凝膠涂抹給藥及腹腔注射給藥（5mg/kg）對芥子氣染毒小鼠耳郭腫脹均無明顯影響。 三、抗炎藥物與其他藥物合用抗芥子氣損傷的藥效評價 芥子氣損傷機制復雜，單一藥物的療效有限，因此，為提高治療效果，需要針對不同的損傷機制采用聯合用藥和綜合性治療措施。聚(ADP-核糖)聚合酶（Poly(ADP-ribose)polymerase，PARP）是目前外軍認為最有前景的抗芥子氣損傷的治療靶點。本課題進一步考察了抗炎藥物與PARP抑制劑合用對抗芥子氣損傷的保護作用。 1.吲哚美辛與PRAP抑制劑合用對小鼠耳郭染毒模型的影響 染毒前給予非甾體抗炎藥吲哚美辛（10mg/kg，po）和PARP抑制劑MUS003（200mg/kg，ip），考察兩者合用對芥子氣染毒皮膚損傷的影響。結果表明，低劑量芥子氣染毒條件下，吲哚美辛組與兩藥合同組均可降低耳腫脹程度，抑制率分別為45.0%和19.1%。高劑量芥子氣染毒條件下，MUS003、吲哚美辛及藥物合用組均可降低耳腫脹程度，抑制率依次是21.8%、28.9%和32.4%。 2.奧伐尼與PRAP抑制劑合用對小鼠耳郭染毒模型的影響染毒前給予辣椒素受體激動劑奧伐尼（0.5mg/耳，涂抹）與PARP抑制劑MUS003（200mg/kg，ip），考察兩者合用對芥子氣染毒皮膚損傷的影響。結果表明，低劑量芥子氣染毒條件下，奧伐尼組與藥物合同組均可降低耳腫脹程度，抑制率分別為56.9%和72.2%，且兩藥抑制耳腫脹具有顯著地交互作用。在高劑量芥子氣染毒條件下，MUS003組與合用組均可降低耳腫脹程度，抑制率為6.5%和28.3%。 結論 1.非甾體抗炎藥吲哚美辛對低（32mg/mL）、高（128mg/mL）染毒劑量所致皮膚損傷具有較好的保護作用。辣椒素受體激動劑奧伐尼對低劑量芥子氣所致皮膚損傷保護作用明顯，優(yōu)于吲哚美辛； 2.非競爭性（變構型）p38抑制劑BIRB796對芥子氣損傷的保護作用強于競爭性p38抑制劑SB203580，這可能與BIRB796同時抑制SM誘導的p38和JNK磷酸化，而SB203580抑制p38激酶同時代償性地引起JNK激酶磷酸化程度升高有關； 3.首次發(fā)現程序性壞死抑制劑可保護芥子氣誘導的表皮細胞死亡，提示這一壞死機制參與了芥子氣誘導的細胞死亡； 4.基于抗炎藥物的藥物組合方案中，奧伐尼與PARP抑制劑MUS003合用對芥子氣染毒小鼠皮膚損傷保護作用優(yōu)于單用方案，可作為備選藥物組合方案進行下一步研究。綜上，本研究通過對基于炎癥反應不同環(huán)節(jié)的多種類別的抗炎藥物進行了抗芥子氣損傷的藥效評價，明確了各類藥物對芥子氣損傷的保護作用及其特點，并提出了基于抗炎藥物的抗芥子氣損傷組合用藥方案，為基于炎性反應的抗芥子氣新藥研究提供了重要的理論依據和實驗基礎。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R994

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本文編號：2491714