【摘要】：第一部分：腫瘤血管破壞劑DMXAA的抗血小板、抗血栓作用及其機制隨著我國人民生活水平的提高,動脈血栓性疾病如冠心病和中風等已超過惡性腫瘤成為導致國人死亡的首要疾病。血小板功能亢進或異常激活引起的血管內血栓形成是此類疾病的病理基礎,抗血小板藥對其治療效果是肯定的。目前臨床上使用的抗血小板藥主要有環(huán)氧化酶抑制劑阿司匹林、P2Y12受體拮抗劑氯吡格雷、磷酸二酯酶(PDE)抑制劑西洛他唑、和整合素allbβ3受體拮抗劑阿昔單抗等,但由于存在阿司匹林抵抗和氯吡格雷抵抗等現(xiàn)象,導致現(xiàn)有的抗血小板藥對某些血栓性疾病患者臨床應用受限,部分患者治療效果未盡如人意。因此,臨床仍需要抗血小板作用更強且副作用更小的藥物面世以改善某些動脈血栓性疾病患者的療效,研究開發(fā)此類藥物仍具有較大的市場。DMXAA作為腫瘤血管破壞劑治療非小細胞肺癌等已進入Ⅲ期臨床試驗,其主要通過破壞腫瘤組織血管導致腫瘤組織血供減少,從而達到抑制腫瘤作用。FAA結構與DMXAA類似,顯著抑制小鼠來源腫瘤,但其作為腫瘤血管破壞劑進入臨床試驗發(fā)現(xiàn)其幾乎不抑制人來源腫瘤。在臨床試驗中發(fā)現(xiàn)患者使用FAA治療時有明顯出血,進一步研究發(fā)現(xiàn)其具有抗血小板、抗血栓作用。雖然,臨床試驗中使用DMXAA治療的患者未見明顯出血,其是否具有抗血小板、抗血栓作用也未見報道,但由于DMXAA與FAA結構類似,均屬于黃酮類藥物,我們推測其具有與FAA類似的抗血小板、抗血栓作用。因此,在本研究中,我們探討DMXAA是否具有抗血小板、抗血栓作用,及其相應機制。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)DMXAA在10-600μmol/L范圍內濃度依賴性地抑制TXA2類似物U46619誘導的阿司匹林處理或未處理的人血小板聚集和ATP釋放。300 μmol/L DMXAA強烈抑制AA、ADP、膠原或瑞斯托酶素誘導的阿司匹林未處理的人血小板聚集和ATP釋放。通過給小鼠尾靜脈注射DMXAA,體外取血檢測發(fā)現(xiàn)DMXAA也抑制U46619、AA、膠原或瑞斯托霉素誘導的小鼠血小板聚集。機制研究發(fā)現(xiàn)DMXAA主要通過抑制血栓素合成酶導致血小板TXA2生成抑制,進而抑制TXA2信號調控下游的Akt和Erk1/2蛋白磷酸化。另外,我們發(fā)現(xiàn)DMXAA也抑制血小板內PDE。最后,我們采用FeCl3誘導的小鼠腸系膜動脈血栓模型和激光誘導的小鼠提睪肌動脈血栓模型均發(fā)現(xiàn)DMXAA靜脈注射給藥顯著抑制體內血栓形成。在與氯吡格雷口服給藥相同的抗血栓作用劑量下,DMXAA靜脈注射給藥小鼠未見明顯出血。綜上所述,在本研究中我們首次發(fā)現(xiàn)DMXAA具有強大的抗血小板、抗血栓作用,且沒有明顯的出血副作用,其抗血小板作用機制為抑制血栓素合成酶導致血小板TXA2生成抑制和PDE抑制導致血小板內cAMP和cGMP水平升高。DMXAA已經在臨床前期試驗和Ⅰ期臨床試驗中顯示藥物安全性好,因此有希望作為一個有效和安全的抗血小板藥物推向市場。第二部分：NOD2增強血小板活化和血栓形成的作用及其機制血小板的主要功能是參與生理性止血和病理性血栓,其功能亢進或異常激活可導致冠心病、中風等動脈血栓性疾病發(fā)生,在此過程中血小板表達的各種信號分子可顯著影響其活化過程。NOD (nucleotide binding oligomerization domain)作為白細胞中的眾多模式識別受體之一,包括NOD1和NOD2,其在機體對抗微生物入侵的天然免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。我們課題組前期研究已經發(fā)現(xiàn)人和小鼠血小板表達NOD2,但不表達NOD1, MDP腹腔注射激活NOD2可增強野生型小鼠血小板對ADP、凝血酶或膠原誘導的血小板聚集和ATP釋放,增強凝血酶誘導的野生型小鼠血小板凝塊收縮反應,但幾乎不影響凝血酶誘導的NOD2基因敲除小鼠血小板凝塊收縮反應,說明NOD2在小鼠血小板活化過程中可能發(fā)揮作用,但對人血小板活化、體內血栓形成的影響及相應機制等尚未闡明。在本部分中我們研究了采用MDP激活NOD2對人血小板活化、體內血栓形成的影響及增強血小板活化的分子機制。我們發(fā)現(xiàn)MDP通過使血小板內NOD2單體變成二聚體從而激活NOD2。體外MDP激活NOD2濃度依賴性地增強凝血酶或膠原誘導的人血小板聚集和ATP釋放。體外MDP激活NOD2增強凝血酶誘導的人血小板凝塊收縮反應,但幾乎不影響血小板在固相纖維蛋白原上鋪展。給FeCl3誘導的小鼠腸系膜動脈血栓模型小鼠腹腔內注射MDP激活NOD2,顯示MDP可增強FeCl3誘導的野生型小鼠腸系膜動脈血栓形成,但幾乎不影響FeCl3誘導的NOD2基因敲除小鼠腸系膜動脈血栓形成。采用抗血小板血清去除小鼠體內血小板,再輸入MDP刺激或未刺激的血小板,最后尾靜脈注射膠原和腎上腺素誘導的肺栓塞模型小鼠觀察小鼠死亡情況,結果顯示輸注MDP刺激的野生型小鼠血小板可導致小鼠肺栓塞死亡率增高,而輸注MDP刺激的NOD2基因敲除小鼠血小板對小鼠肺栓塞死亡率幾乎不影響,說明MDP激活血小板NOD2可導致小鼠肺栓塞死亡率增高,進一步說明MDP激活NOD2增強體內血栓形成主要是通過激活血小板NOD2。小鼠斷尾出血量檢測顯示MDP激活NOD2可使野生型小鼠出血量減少,而在NOD2基因敲除小鼠中則無此作用,說明MDP激活血小板NOD2也加速了血小板依賴的止血。進一步研究機制,首次發(fā)現(xiàn)血小板表達受體相互作用蛋白-2 (receptor-interacting protein 2, RIP2), MDP激活血小板NOD2導致RIP2磷酸化增加,進一步激活RIP2調控的下游MAPK信號通路和cGMP/PKG通路,從而發(fā)揮NOD2激活增強血小板活化的作用。綜上所述,本部分研究揭示了MDP激活NOD2增強人血小板活化和體內血栓形成,并闡明了相應的分子機制,其主要是激活下游調控的RIP2/MAPKs通路和RIP2/cGMP/PKG通路發(fā)揮作用,這較好地解釋了一些炎癥患者如克羅恩氏病(Crohn's disease)等為何易發(fā)動脈血栓性疾病,為治療此類患者易發(fā)的動脈血栓性疾病提供了理論基礎和實驗依據(jù)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R965

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本文編號：2477434