【摘要】：甜菊糖苷,一種貝殼杉烯型四環(huán)二萜類化合物,是天然甜味劑甜菊糖的主要成分之一,已被廣泛應(yīng)用于食品、飲料、醫(yī)藥等行業(yè)。早期研究表明,甜菊糖不但具有高甜低熱的特性,同時(shí)還具有多種藥理活性,如抗高血壓、抗糖尿病、抗齟齒等。本文以甜菊糖主要成分萊鮑迪苷A(RA)、甜菊醇(SV)及其體內(nèi)主要代謝物葡糖醛酸結(jié)合物(SVG)為研究對(duì)象,利用微粒體、重組酶、細(xì)胞、動(dòng)物等實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?從體外、體內(nèi)兩方面闡明其代謝轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,同時(shí)基于代謝轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制考察甜菊糖與藥物合用時(shí)可能產(chǎn)生的潛在相互作用,為其安全合理應(yīng)用提供依據(jù)。本研究首先建立了快速、靈敏的LC-MS/MS方法用于檢測(cè)樣品中SVG的含量。樣品經(jīng)乙腈沉淀蛋白處理后,使用C18色譜柱(2.3x50 mm,5μm)進(jìn)行液相分離,在負(fù)離子MRM模式下檢測(cè)SVG。線性范圍為2-1000 nM,方法具有良好的重現(xiàn)性。為闡明SV在體內(nèi)的代謝清除機(jī)制,我們利用肝微粒體和腸微粒體對(duì)SV的內(nèi)在清除率進(jìn)行了考察。首先,對(duì)蛋白濃度和孵育時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化發(fā)現(xiàn),蛋白濃度0.2 mg/ml和反應(yīng)時(shí)間5 min最佳。在人、鼠肝微粒體和腸微粒體四種代謝體系中,SV均能快速發(fā)生葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)生成SVG,且呈現(xiàn)明顯的底物抑制現(xiàn)象。在人和大鼠中,SVG的生成速率相似,但肝微粒體中SVG生成速率顯著高于腸微粒體,提示肝是SV發(fā)生葡萄糖醛酸化反應(yīng)的主要器官。為進(jìn)一步闡明SVG在體內(nèi)的生成機(jī)制,本研究利用12種FDA規(guī)定的重組人UGT酶亞型進(jìn)行底物篩查。結(jié)果表明,在苷元濃度為2 μM時(shí),UGT2B7可介導(dǎo)SV快速發(fā)生葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng),催化生成SVG;當(dāng)苷元濃度升到20μM時(shí),UGT2B7和UGT1A3均可顯著介導(dǎo)SVG的生成。隨后在兩種重組酶中的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了考察。結(jié)果表明,與微粒體類似,在重組酶中同樣出現(xiàn)了明顯的底物抑制現(xiàn)象。提示UGT2B7是介導(dǎo)人體內(nèi)SV發(fā)生葡萄糖醛酸化的主要二相代謝酶。本研究進(jìn)一步地考察了人體主要外排轉(zhuǎn)運(yùn)體和攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體是否參與SVG的處置過(guò)程。我們首先利用穩(wěn)定表達(dá)hMDR1、hBCRP、hMRP2或hMATE1的MDCKⅡ細(xì)胞進(jìn)行雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,這些外排轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)SVG的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)明顯作用。隨后,我們利用穩(wěn)定表達(dá)攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體hOAT1、hOAT3、hOCT2、hOATP1A2、hOATP1B1、 hOATP1B3或hOATP2B1的HEK293細(xì)胞系進(jìn)行考察。結(jié)果表明,hOAT3及hOATPs對(duì)SVG的細(xì)胞攝取起重要作用,且hOAT3對(duì)SVG的排泄作用遠(yuǎn)高于hOATPs,提示hOAT3是介導(dǎo)SVG體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)清除的主要轉(zhuǎn)運(yùn)體。為了進(jìn)一步研究是否存在SV與藥物的相互作用,我們對(duì)SV與藥物或天然小分子化合物之間的相互作用進(jìn)行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn),UGT2B7的底物齊多夫定、氟哌啶醇、雙氯芬酸對(duì)SVG生成均有不同程度的抑制作用,其中以雙氯芬酸的抑制作用最強(qiáng),Ki為4.2μM,屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制。并且,SV可反作用于雙氯芬酸,抑制其代謝清除。提示SV與雙氯芬酸之間可能存在UGT2B7介導(dǎo)的相互作用�；谵D(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的相互作用研究發(fā)現(xiàn),多種藥物和天然小分子化合物可顯著抑制SVG的細(xì)胞攝取,尤其是hOAT3及hOATP1B3介導(dǎo)的細(xì)胞攝取。其中,抑制作用最強(qiáng)的是槲皮素、替米沙坦、雙氯芬酸和桑皮黃素,對(duì)hOAT3的攝取抑制作用IC50值分別為1.82μM、2.92 μM/8.01μM和9.97μM。在大鼠原代肝細(xì)胞中的研究表明,SVG可顯著被原代肝細(xì)胞攝取,替米沙坦及桑皮黃素可顯著抑制這一過(guò)程,且具有明顯的濃度依賴性,IC50值分別為2.0μM和7.1μM。大鼠體內(nèi)相互作用研究發(fā)現(xiàn),同時(shí)灌胃給予大鼠RA (15mg/kg)和替米沙坦(8 mg/kg)后,替米沙坦可顯著升高體內(nèi)SVG的暴露量和最大血藥濃度,但對(duì)RA沒(méi)有明顯作用。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)食用甜菊糖后,胃腸道生成的SV主要在肝臟通過(guò)UGT2B7介導(dǎo)生成葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物SVG,隨后SVG通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)體hOAT3和hOATPs轉(zhuǎn)運(yùn),主要經(jīng)腎臟排出體外。本研究首次闡明了甜葉菊提取物特別是萊鮑迪苷A(RA)食用后的代謝轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,同時(shí)發(fā)現(xiàn)多種藥物或天然化合物可以產(chǎn)生基于代謝轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的SV-藥物相互作用。鑒于大多數(shù)植物有效成分以糖苷形式存在于自然界,其代謝過(guò)程主要包括胃腸道水解、一相及二相代謝,本論文的研究思路和成果為甜菊糖的臨床合理、安全應(yīng)用(如糖尿病病人血糖控制等)提供了科學(xué)依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R96

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本文編號(hào)：2476472