【摘要】：目的:建立液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用肽圖分析方法用于抗人腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α)單抗的專屬性鑒別。方法:TNF-α單抗樣品經(jīng)鹽酸胍變性、還原,釋放出的游離半胱氨酸殘基進行烷化,還原劑中和過量的烷化劑。超濾置換酶切緩沖液后進行胰酶酶切并終止。色譜條件:采用Waters UPLC BEH 300 C_(18)(2.1 mm×150mm,1.7μm)色譜柱,以0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈溶液(B)為流動相,梯度洗脫(5-120 min,2%B→45%B),流速為0.2 mL·min~(-1),檢測波長為214 nm;質(zhì)譜條件:采用電噴霧離子源及正離子模式,數(shù)據(jù)采集范圍m/z為100~1990。結(jié)果:TNF-α單抗重鏈及輕鏈的6個互補決定區(qū)(CDR)對應(yīng)肽段由質(zhì)譜鑒定出,HC CDR2及HC CDR3在色譜峰圖中共流出;利妥昔單抗用于評估本方法的專屬性,結(jié)果顯示本方法專屬性強,且不受基質(zhì)的干擾;選定m/z 1 344(M~(+5))的色譜峰為參考峰,根據(jù)CDR的相對保留時間考察該方法的變異程度,5次重復(fù)測定CDR相對保留時間的RSD在0.57%~1.19%之間;中間精密度考察測定的相對保留時間的RSD在0.00%~1.08%之間;胰酶酶切比例在20:1~30:1,酶切時間在17~23h范圍內(nèi)變化時,相對保留時間的均較小,符合方法耐用性的要求;樣品消化后在8℃儲存24h以及-20℃儲存5d的穩(wěn)定性良好。結(jié)論:基于CDR相關(guān)肽段鑒別的液質(zhì)聯(lián)用肽圖分析方法可定性鑒定出TNF-α單抗,方法學(xué)驗證結(jié)果顯示該方法適用于抗人TNF-α單抗的專屬性鑒別,可用于其質(zhì)量控制及批檢驗放行。
[Abstract]:......
【作者單位】： 武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司;
【基金】：國家科技重大專項課題資助項目(2011ZX09506-005)
【分類號】：R927

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本文編號：2476289