【摘要】：細胞外囊泡(Extracellular vesicle, EV)是一種由細胞分泌的直徑在30-100nm之間的雙層膜包被的囊泡,通常也被稱為微囊泡(Microvesicle, MV)或外泌體(Exosome)。EV通過介導細胞間的信號交流參與到很多生理過程及病理過程中。研究表明,細胞分泌的EV中包含miRNA,這些miRNA可以被運送至受體細胞并通過改變靶基因的表達調(diào)控受體細胞的功能。因此,越來越多的研究開始關注EV是否能夠成為一種有效的體內(nèi)核酸藥物遞送載體。為了從理論上確定細胞分泌的EV具備作為藥物運送載體的可能性,我們首先對細胞分泌的EV的生物及物理性質做了分析。人胚腎細胞293T細胞系是目前常用的一種體外包裹分泌小核糖核酸的細胞系,因此我們首先對293T細胞的EV作為藥物運送載體的可能性進行了分析。首先我們對293T細胞來源的外泌體中蛋白質,mRNA和miRNA的表達譜進行了鑒定。然后我們對這些數(shù)據(jù)進行了基因本體(GO)分析和京都基因和基因組百科全書(KEGG)信號通路分析。生物信息學的分析結果表明293T細胞來源的外泌體中蛋白質,mRNA和miRNA組成不會顯著影響受體細胞的生物學功能,也沒有明顯的組織特異性。我們定量對比分析了293T細胞轉染功能性小RNA分子是否會改變外泌體蛋白質的表達,實驗結果表明轉染功能性小RNA分子基本不會影響293T來源的外泌體的蛋白表達水平。我們的研究結果從理論上表明293T來源的外泌體適合作為一種體內(nèi)藥物遞送載體。在此基礎上,我們開始對EV作為藥物載體的可行性進行研究。我們發(fā)現(xiàn)腫瘤個體內(nèi),EV包裹的miR-150可以被遞送至腫瘤相關巨噬細胞(TAM)通過上調(diào)其表達血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)從而促進腫瘤的生長。這一現(xiàn)象說明miR-150在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。為了證實miR-150可以作為腫瘤治療的靶點,我們對體內(nèi)miR-150的水平進行干預并觀察小鼠腫瘤生長情況。在治療過程中,我們制備包裹著miR-150反義序列的293T EV并對植瘤小鼠進行尾靜脈注射。結果顯示,EV包裹的miR-150反義序列(anti-miR-150)可以有效降低循環(huán)系統(tǒng)和腫瘤中miR-150和VEGF的表達水平,從而通過抑制腫瘤的血管新生抑制了腫瘤的生長。綜上所述,我們不僅發(fā)現(xiàn)了miR-150在腫瘤生長過程中的作用,同時還提出了一種潛在的治療癌癥的新方法,即通過注射EV包裹的反義RNA序列來降低關鍵miRNA的表達從而達到治療腫瘤的效果。為了進一步證實EV做為核酸藥物體內(nèi)運送載體的可能性,我們利用EV包裹siRNA來治療阿片類藥物的成癮。在這一部分實驗中,我們通過基因工程手段在EV表面表達了乙酰膽堿受體的肽段RVG,使得改造后的EV獲得穿過血腦屏障、特異性到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)的能力。利用這種改造過的EV,我們有效的將介導阿片成癮的關鍵蛋白OPRM的siRNA運送至腦中。結果顯示RVG修飾的包裹的siRNA的EV可以有效降低小鼠腦中OPRM的蛋白質和mRNA的表達水平,并且在成癮小鼠模型中強烈抑制了成癮小鼠的復吸行為。我們的實驗結果提供了一種治療毒品成癮復吸的新策略。綜上所述,細胞分泌的EV可以作為一種有效的藥物運送載體。并且和其他已知的藥物運送載體相比,它具有毒性小、無免疫排斥等優(yōu)勢。目前基于siRNA等手段的基因治療成為一種很有潛力的治療方式,但是siRNA的運送問題一直是制約siRNA治療的瓶頸。我們的發(fā)現(xiàn)為siRNA藥物遞送提供了新的思路,并且通過改造EV,可以使EV具有靶向性,更有效更特異的進行靶向治療。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R943

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本文編號：2473054