【摘要】：細(xì)胞外囊泡(Extracellular vesicle, EV)是一種由細(xì)胞分泌的直徑在30-100nm之間的雙層膜包被的囊泡,通常也被稱為微囊泡(Microvesicle, MV)或外泌體(Exosome)。EV通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞間的信號(hào)交流參與到很多生理過(guò)程及病理過(guò)程中。研究表明,細(xì)胞分泌的EV中包含miRNA,這些miRNA可以被運(yùn)送至受體細(xì)胞并通過(guò)改變靶基因的表達(dá)調(diào)控受體細(xì)胞的功能。因此,越來(lái)越多的研究開(kāi)始關(guān)注EV是否能夠成為一種有效的體內(nèi)核酸藥物遞送載體。為了從理論上確定細(xì)胞分泌的EV具備作為藥物運(yùn)送載體的可能性,我們首先對(duì)細(xì)胞分泌的EV的生物及物理性質(zhì)做了分析。人胚腎細(xì)胞293T細(xì)胞系是目前常用的一種體外包裹分泌小核糖核酸的細(xì)胞系,因此我們首先對(duì)293T細(xì)胞的EV作為藥物運(yùn)送載體的可能性進(jìn)行了分析。首先我們對(duì)293T細(xì)胞來(lái)源的外泌體中蛋白質(zhì),mRNA和miRNA的表達(dá)譜進(jìn)行了鑒定。然后我們對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行了基因本體(GO)分析和京都基因和基因組百科全書(shū)(KEGG)信號(hào)通路分析。生物信息學(xué)的分析結(jié)果表明293T細(xì)胞來(lái)源的外泌體中蛋白質(zhì),mRNA和miRNA組成不會(huì)顯著影響受體細(xì)胞的生物學(xué)功能,也沒(méi)有明顯的組織特異性。我們定量對(duì)比分析了293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染功能性小RNA分子是否會(huì)改變外泌體蛋白質(zhì)的表達(dá),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染功能性小RNA分子基本不會(huì)影響293T來(lái)源的外泌體的蛋白表達(dá)水平。我們的研究結(jié)果從理論上表明293T來(lái)源的外泌體適合作為一種體內(nèi)藥物遞送載體。在此基礎(chǔ)上,我們開(kāi)始對(duì)EV作為藥物載體的可行性進(jìn)行研究。我們發(fā)現(xiàn)腫瘤個(gè)體內(nèi),EV包裹的miR-150可以被遞送至腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)通過(guò)上調(diào)其表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。這一現(xiàn)象說(shuō)明miR-150在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用。為了證實(shí)miR-150可以作為腫瘤治療的靶點(diǎn),我們對(duì)體內(nèi)miR-150的水平進(jìn)行干預(yù)并觀察小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況。在治療過(guò)程中,我們制備包裹著miR-150反義序列的293T EV并對(duì)植瘤小鼠進(jìn)行尾靜脈注射。結(jié)果顯示,EV包裹的miR-150反義序列(anti-miR-150)可以有效降低循環(huán)系統(tǒng)和腫瘤中miR-150和VEGF的表達(dá)水平,從而通過(guò)抑制腫瘤的血管新生抑制了腫瘤的生長(zhǎng)。綜上所述,我們不僅發(fā)現(xiàn)了miR-150在腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中的作用,同時(shí)還提出了一種潛在的治療癌癥的新方法,即通過(guò)注射EV包裹的反義RNA序列來(lái)降低關(guān)鍵miRNA的表達(dá)從而達(dá)到治療腫瘤的效果。為了進(jìn)一步證實(shí)EV做為核酸藥物體內(nèi)運(yùn)送載體的可能性,我們利用EV包裹siRNA來(lái)治療阿片類藥物的成癮。在這一部分實(shí)驗(yàn)中,我們通過(guò)基因工程手段在EV表面表達(dá)了乙酰膽堿受體的肽段RVG,使得改造后的EV獲得穿過(guò)血腦屏障、特異性到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的能力。利用這種改造過(guò)的EV,我們有效的將介導(dǎo)阿片成癮的關(guān)鍵蛋白OPRM的siRNA運(yùn)送至腦中。結(jié)果顯示RVG修飾的包裹的siRNA的EV可以有效降低小鼠腦中OPRM的蛋白質(zhì)和mRNA的表達(dá)水平,并且在成癮小鼠模型中強(qiáng)烈抑制了成癮小鼠的復(fù)吸行為。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供了一種治療毒品成癮復(fù)吸的新策略。綜上所述,細(xì)胞分泌的EV可以作為一種有效的藥物運(yùn)送載體。并且和其他已知的藥物運(yùn)送載體相比,它具有毒性小、無(wú)免疫排斥等優(yōu)勢(shì)。目前基于siRNA等手段的基因治療成為一種很有潛力的治療方式,但是siRNA的運(yùn)送問(wèn)題一直是制約siRNA治療的瓶頸。我們的發(fā)現(xiàn)為siRNA藥物遞送提供了新的思路,并且通過(guò)改造EV,可以使EV具有靶向性,更有效更特異的進(jìn)行靶向治療。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R943

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本文編號(hào)：2473054