【摘要】：生物膜系統(tǒng)具有阻擋外源傷害,維持生命活動穩(wěn)定、有序進行的功能。生物膜系統(tǒng)作為生物體的外層結(jié)構(gòu),為生命活動的進行提供必要的能量、信息、物質(zhì)的交換。生物膜系統(tǒng)的選擇性通透能力為生物體提供交換途徑的同時也起到保護作用。對于作用靶點在胞內(nèi)的藥物,其發(fā)揮作用的先決條件是要穿透細胞膜進入細胞內(nèi)。然而生物膜的屏障作用阻止了許多藥物的滲透,從而很大程度上限制了這類藥物分子的生物利用率。因而,生物膜滲透能力成為藥物篩選的重要研究內(nèi)容。近三十年間,生物膜系統(tǒng)的功能性與藥物滲透性研究由復(fù)雜的體內(nèi)實驗逐漸發(fā)展到體外實驗。體外模型涵蓋了計算機模擬、分子水平、人工膜水平、細胞水平、組織水平實驗等諸多方式。然而在滲透性檢測方法上的突破十分有限,目前的研究報道大多基于熒光標記、電學信號檢測等模式。然而部分熒光標記分子對細胞功能可能具有一定的影響,且熒光修飾改變了藥物分子的原有結(jié)構(gòu),難以在接近真實環(huán)境中進行藥物滲透能力的檢測。電學信號檢測的芯片結(jié)構(gòu)和設(shè)備較為復(fù)雜,電極容易受到污染,方法重現(xiàn)性較差。為克服現(xiàn)有研究方法的缺點,本論文旨在建立一種非標記光學檢測方法,用于生物膜功能和藥物滲透性的研究。論文構(gòu)建了基于硅納米孔陣列的支撐人工生物膜系統(tǒng),利用硅納米孔陣列的微結(jié)構(gòu)和反射干涉光學現(xiàn)象研究了人工生物膜系統(tǒng)對納米孔的封閉效應(yīng)。在所構(gòu)建的光學傳感平臺上研究了離子通道蛋白對氫離子的選擇性通透功能,同時研究了肽類物質(zhì)的跨膜行為,以及藥物分子跨越內(nèi)皮細胞的能力。上述研究工作為非標記光學傳感器應(yīng)用于藥物篩選奠定了基礎(chǔ)。本論文的主要內(nèi)容如下：(1) 構(gòu)建了一種硅納米孔陣列-水凝膠復(fù)合材料支撐型人工細胞膜系統(tǒng),在H+敏感水凝膠的信號放大作用下,研究了復(fù)合材料在微環(huán)境下對H+的高靈敏傳感能力,采用微流控技術(shù)成功構(gòu)建了納米孔陣列支撐的磷脂雙分子層(Phospholipid bilayers, PLBs),傅里葉變換反射干涉光譜(Fourier transferred-reflectometric interference spectrum, FT-RIS)結(jié)果表明PLBs能有效阻斷溶液中的H+向納米孔陣列的擴散。在PLBs中鑲嵌離子通道蛋白(短桿菌肽A)后,該人工細胞膜恢復(fù)了部分離子通透功能。在此基礎(chǔ)上研究了離子通道抑制劑的抑制作用,建立了離子通道靶向藥物篩選的模型。(2) 構(gòu)建了一種硅納米孔陣列表面支撐型人工細胞膜系統(tǒng),基于人工細胞膜對納米孔陣列表面非跨膜生物分子的封閉作用,建立了多肽跨越細胞膜過程的實時光學檢測方法,研究了TP2、Cecropin A、hIAPP、Dermaseptin等多種跨膜肽(Membrane-translocating peptides, MTPs)分子跨越細胞膜的動力學過程,建立了不同類型MTPs的區(qū)分模型,結(jié)果與真實微生物抗菌結(jié)果、真實細胞膜相互作用結(jié)果相吻合。最終建立了針對載體型MTPs和抗菌型MTPs的藥物篩選模型。(3) 構(gòu)建了一種硅納米孔陣列支撐的體外血腦屏障(Blood-brain barrier, BBB)系統(tǒng),基質(zhì)膠Matrigel(?)共培養(yǎng)狀態(tài)下成功實現(xiàn)了人腦微血管內(nèi)皮細胞hBMECs的體外培養(yǎng)并形成了緊密連接結(jié)構(gòu)�；贐BB對納米孔陣列表面非滲透型分子的封閉作用,建立了體外BBB的非標記光學檢測方法,研究了不同培養(yǎng)時間下體外BBB通透性的改變,用乙酰膽堿、熒光素鈉等模型分子驗證了所構(gòu)建的體外模型。用該模型測試了氯霉素、環(huán)丙沙星、紅霉素等多種抗生素對BBB的滲透能力,建立了腦外傷藥物的體外篩選模型。(4) 構(gòu)建了一種硅納米孔陣列表面固定微生物層的系統(tǒng),基于硅納米孔陣列的封閉效應(yīng),建立了微生物的非標記分析方法。將特定抗體(E.Coli抗體)固定于納米孔陣列表面并捕獲E.Coli后,微生物層對納米孔陣列的分子通透產(chǎn)生阻礙作用。以BSA作為探針分子,通過測量不同封閉狀態(tài)下BSA對多孔層光學信號的變化,建立了用于微生物層密度定量分析的非標記光學方法,上述方法在抗菌藥物篩選中具有潛在的應(yīng)用價值。(5) 論文的最后一章介紹了作者在美國斯坦福大學醫(yī)學院交流訪問期間所做的研究工作,建立了一種用于疾病診斷的比色陣列傳感器。該比色陣列對不同來源的尿液樣本能產(chǎn)生特征光學響應(yīng),利用成像系統(tǒng)和信息學圖像分析方法提取光學響應(yīng)信號,并利用統(tǒng)計學算法篩選出陣列式傳感的最優(yōu)化組成。在最優(yōu)化條件下實現(xiàn)了川崎病和普通發(fā)燒患者之間的區(qū)分,在訓練組中靈敏度和特異性分別為0.94和0.91(其ROC AUC值達到0.981),測試組中則達到0.94和0.82 (ROC AUC值為0.873)。利用統(tǒng)計學算法進行文獻信息挖掘并探討了該傳感器的作用機理。
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【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R943
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本文編號：2438066