【摘要】：背景:達托霉素為新型環(huán)脂肽類抗生素,是治療由革蘭氏陽性耐藥菌株所引起感染的最佳治療藥物,因其對MRSA(耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)、VRE(耐萬古霉素的腸球菌)和PRSP(耐青霉素的肺炎鏈球菌)等高致病臨床耐藥菌株有很好的殺菌作用,因此被譽為“超級抗生素”。達托霉素是由玫瑰孢鏈霉菌S.roseosporus NRRL 15998通過非核糖體肽合成酶(NRPS)所產(chǎn)生的環(huán)脂肽類抗生素復合物中很小的一個組分。由于其在臨床上重要的應用價值,且在玫瑰孢鏈霉菌中產(chǎn)量很低,不能滿足臨床治療和生產(chǎn)的需要,促使我們研究達托霉素的合成調(diào)控機制,通過代謝工程和合成生物學方法來提高達托霉素產(chǎn)量。Arg R是細菌中普遍存在的調(diào)控精氨酸代謝的調(diào)控因子,在調(diào)控精氨酸代謝的同時也能調(diào)控其他代謝途徑相關基因的表達。在鏈霉菌中,Arg R是精氨酸生物合成基因的調(diào)控因子。精氨酸或參與精氨酸生物合成的氨基酸是眾多次級代謝產(chǎn)物合成的前體,因此Arg R廣泛調(diào)控次級代謝的生物合成;Arg R在棒狀鏈霉菌中參與嘌呤、棒酸的代謝調(diào)控及全霉素的生物合成;在天藍色鏈霉菌中參與次級代謝過程中色素的合成和相關基因的轉錄調(diào)控;精氨酸生物合成的中間產(chǎn)物鳥氨酸是達托霉素的重要前體,Arg R是否調(diào)控達托霉素的合成及其分子機制是一個重要的科學問題。目的:利用蛋白質組學方法比較野生型與兩株不同來源的達托霉素高產(chǎn)菌株,發(fā)現(xiàn)在兩株高產(chǎn)菌株中Arg R的表達顯著下調(diào),Arg J表達也下調(diào),而Arg G表達上調(diào),暗示Arg R可能影響達托霉素生物合成,本研究旨在S.roseosporus NRRL 15998中闡明Arg R對達托霉素生物合成機制的調(diào)控作用,Arg R對發(fā)育分化及次級代謝抗生素生物合成的影響,為解析Arg R在玫瑰孢鏈霉菌中的生物學功能、調(diào)控分子機制和提高達托霉素產(chǎn)量提供依據(jù)。方法:1.對S.roseosporus基因組序列進行生物信息學分析,在玫瑰孢鏈霉菌基因組中確定編碼精氨酸抑制因子Arg R的基因argR;利用Clustal X、ESpript軟件對Arg R蛋白的同源性進行比對;對Arg R蛋白的保守結構域進行初步預測;2.為研究S.roseosporus中argR的功能,在本實驗室構建的玫瑰孢鏈霉菌Fosmid文庫的基礎上,通過PCR-targeting方法,利用同源重組的原理在S.roseosporus中構建argR敲除菌株,以p SET152-kan載體出發(fā)構建遺傳互補菌株,以p IJ8660-erm E*p載體出發(fā)構建過表達菌株;3.為在S.roseosporus中研究argR對發(fā)育分化的影響,在不同培養(yǎng)基和含有不同金屬離子的AS-I培養(yǎng)基中對玫瑰孢鏈霉菌菌絲發(fā)育分化進行研究,比較突變菌株和野生型菌株之間表型的差異來研究argR對發(fā)育分化的影響;4.通過實時熒光定量PCR(q RT-PCR)實驗探究S.roseosporus中argR對精氨酸生物合成基因簇兩個轉錄單元轉錄水平的影響;通過半定量PCR(RT-PCR)實驗探究S.roseosporus中argR是否能夠激活基因組中沉默基因簇的表達;5.為研究argR對次級代謝生物合成的影響,對野生型、敲除株、回補株及過表達株進行了發(fā)酵實驗,以藤黃微球菌為指示菌對發(fā)酵液的生物活性進行了檢測;繪制菌體生長曲線和抗生素產(chǎn)量的實時曲線。通過q RT-PCR實驗進一步證實argR對次級代謝達托霉素生物合成的轉錄調(diào)控作用;6.構建Arg R蛋白表達載體p ET23b-Arg R,純化Arg R蛋白,通過EMSA實驗初步探究Arg R蛋白對精氨酸生物合成基因簇及達托霉素生物合成基因簇中關鍵基因的結合能力;結果:1.在S.roseosporus中確定argR在基因組中的位置為SSGG_00667。以Fosmid文庫質粒為基礎,在S.roseosporus中成功構建argR的敲除株argRDM、互補株argRDMC和過表達株argROE;2.在固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中觀察WT、argRDM和argROE生長狀況,發(fā)現(xiàn)菌絲表型沒有差別,產(chǎn)孢及產(chǎn)色素情況沒有差異,WT和argRDM能在含有0.25M鈣離子的培養(yǎng)基中產(chǎn)孢,而argROE幾乎不產(chǎn)孢,且argRDM的產(chǎn)孢量是WT的170倍,并用掃描電鏡觀察證實argR敲除后能夠促進菌絲分化;3.S.roseosporus中argR敲除后使A21978C產(chǎn)量降低21%,而過表達使次級代謝抗生素的產(chǎn)量提高1.6倍;4.與WT相比argRDM能夠使調(diào)控達托霉素產(chǎn)量的關鍵基因atr A、dpt E、dpt R2和dpt R3的轉錄水平在48h分別降低26%、21.36%、73.28%和27.12%,72h分別降低51.15%、75.45%、77.88%和29.82%,96h分別降低65.87%、25.09%、15.07%和18.75%,而調(diào)控精氨酸生物合成的兩個轉錄單元arg CJBDR和arg GH的轉錄水平平均提高60倍和100倍左右;5.構建Arg R蛋白表達載體p ET23b-Arg R,并純化Arg R蛋白,濃度為8mg/m L;6.通過EMSA實驗證實Arg R對atr A、dpt E、dpt R2、dpt R3、arg CJBDR和arg GH都有不同程度的結合作用;7.在S.roseosporus中argR基因的突變不能夠激活特定沉默基因簇中基因的表達;8.對WT、argRDM菌體和發(fā)酵液中氨基酸含量進行檢測發(fā)現(xiàn)絲氨酸含量分別降低39.72%和13.1%,精氨酸含量分別升高77.44%和180.43%;結論:本研究結果顯示S.roseosporus中argR對菌絲生長發(fā)育沒有顯著的影響,在鈣離子豐富的培養(yǎng)基中能夠顯著影響孢子產(chǎn)量;argR能夠影響次級代謝抗生素的生物合成,即argR能夠影響初級代謝過程中前體絲氨酸的合成而調(diào)控達托霉素的產(chǎn)生;并且argR能夠調(diào)控關鍵基因dpt E、dpt R2、dpt R3和atr A的轉錄水平而間接調(diào)控達托霉素的合成;argR不能夠激活S.roseosporus中特定沉默基因簇中基因的表達;在S.roseosporus中argR能夠影響精氨酸生物合成轉錄單元的轉錄;我們首次探索argR在S.roseosporus中的功能,這為后續(xù)研究argR的功能及S.roseosporus進行代謝工程的改造奠定了堅實的基礎。
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【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R915

【參考文獻】

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1 謝祥茂;王鳳;陳俊勇;張宇鍇;毛旭明;李永泉;;達托霉素生物合成研究進展[J];微生物學通報;2013年10期

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本文編號：2434327