【摘要】：細胞色素P450(Cytochrome P450 proteins,CYPs)是一類混合功能氧化酶和血紅素酶系統(tǒng),廣泛存在于動物、植物、微生物體內(nèi),參與代謝各類化學物,包括藥物、農(nóng)藥、致癌物質(zhì)、除草劑、食品添加劑及其它類型的化合物的。據(jù)報道,人體內(nèi)CYPs參與了90%以上藥物代謝反應[1]。然而當化合物對其活性具有抑制作用時,可能導致其它化合物的代謝受阻,造成藥物相互作用,96%的代謝性藥物相互作用是由CYPs介導的,而由抑制導致的藥物相互作用占代謝性藥物相互作用的70%[1]。在新藥研發(fā)進程中,確定負責各候選藥物代謝的特定CYPs亞型,以及該候選藥物是否會有抑制或誘導CYPs的可能是非常重要的。體外利用人肝微粒體及探針底物(probe substrate)法的反應模型是評價藥物對混合人肝微粒蛋白(HLM)中CYPs影響狀況的最常用的方法之一。一直以來,該反應模型都是通過人工玻璃管孵育完成。受限于操作者的科研經(jīng)驗及試驗操作規(guī)范、熟練程度、甚至情緒變化,人工玻璃管孵育法在精準度方面存在一定的缺陷,并且人工玻璃孵育法難以實現(xiàn)高通量化研究。本研究中,建立了一套基于Tecan RSP 100/8 Genesis series液體處理工作站及IKA KS 130小型振蕩搖床定制改造而來,用于評價候選藥物對CYPs抑制情況的自動微型化平臺。優(yōu)化反應條件,使用96孔板進行全自動化的孵育操作,所有的試劑通過Tecan液體處理工作站的針頭移送到96孔板的指定孔位,該工作站能夠處理大批量試劑及化合物的稀釋過程,同時振蕩搖床為酶反應提供了所必須的恒溫及振蕩環(huán)境。反應終止后,建立快速化LC-MS/MS分析方法對代謝產(chǎn)物進行分析。本研究建立了兩套自動化孵育程序,一套用于同時執(zhí)行單一濃度多化合物對多種CYPs抑制情況的初步評價;另一套用戶同時執(zhí)行多個濃度多個化合物對單一CYP抑制情況的評價,即可用于半數(shù)抑制劑量(IC50)的計算。設定前者初步評價程序可以幫助判斷是否有進行完整IC50值測算操作的必要。每種CYPs都加入其特異性的陽性參考抑制劑,并測算陽性參考抑制劑IC50值,結(jié)果均在文獻參考范圍內(nèi),一定程度上證明了這套體系的正確性。最后本研究使用此套自動化系統(tǒng)研究了大黃4種主要成分對CYPs的抑制作用,研究結(jié)果表明大黃酚對2E1,大黃酸對2C19、2E1,大黃素對2C8、2C19,蘆薈大黃素對2B6、2C19有較強烈的抑制作用。對于三種最主要的CYPs亞型3A4/5、2D6、2C9,本研究進行了其IC50值的測定,其中大黃素對3A4/5、2D6抑制IC50值分別為15.82 mol/L、12.68 mol/L;大黃素酚對3A4/5的IC50值為18.40 mol/L;大黃酸對2C9的IC50值為24.17 mol/L,其余組別測得IC50值均大于25.00 mol/L。為大黃藥用價值進一步開發(fā)過程中,中藥配伍造成可能的藥物相互作用或食藥相互作用風險提供參考。
[Abstract]:Cytochrome P450 proteins,CYPs (Cytochrome P450 proteins,CYPs) is a kind of mixed functional oxidase and heme enzyme system, which widely exists in animals, plants and microorganisms, and is involved in the metabolism of various chemicals, including drugs, pesticides, carcinogens, herbicides, and herbicides. Food additives and other types of compounds. CYPs is reported to be involved in more than 90% of drug metabolic reactions [1]. However, when compounds inhibit their activity, it may lead to the inhibition of metabolism of other compounds, resulting in drug interactions, 96% of which are mediated by CYPs. Drug interactions due to inhibition account for 70% of metabolic drug interactions [1]. In the process of new drug development, it is important to determine the specific CYPs subtypes responsible for the metabolism of each candidate drug and whether the candidate drug may inhibit or induce CYPs. (probe substrate) reaction model using human liver microsomes and probe substrates in vitro is one of the most commonly used methods to evaluate the effect of drugs on CYPs in (HLM) of mixed human hepatic microsomes. All along, the model has been incubated with artificial glass tubes. Limited by the operator's scientific research experience and operating standard, proficiency and even emotional changes, the artificial glass tube incubation method has some defects in precision, and the artificial glass incubation method is difficult to achieve high-throughput research. In this study, an automatic miniaturization platform was established based on Tecan RSP 100 / 8 Genesis series liquid processing workstation and IKA KS 130 small oscillatory shaking bed to evaluate the inhibition of candidate drugs to CYPs. Optimization of reaction conditions, the use of 96 hole plate for full automatic incubation operation, all reagents are transferred through the needle of the Tecan liquid treatment workstation to the designated hole position of the 96 hole plate. The workstation can handle the dilution process of a large quantity of reagents and compounds. At the same time, oscillating shaking table provides the necessary constant temperature and oscillating environment for enzyme reaction. After the reaction was terminated, a rapid LC-MS/MS analysis method was established for the analysis of metabolites. In this study, two sets of automated incubation procedures were established. One set was used to perform a preliminary evaluation of the inhibition of multiple CYPs by a single concentration of multiple compounds. Another set of users simultaneously performed multiple concentrations of multiple compounds to evaluate the inhibition of a single CYP, which can be used to calculate the half inhibitor dose (IC50). Setting up a preliminary evaluation program for the former can help to determine whether there is a need for a complete IC50 calculation operation. Each CYPs was added with its specific positive reference inhibitors, and the IC50 value of the positive reference inhibitors was calculated. The results were all within the scope of references, which to some extent proved the correctness of the system. Finally, the inhibitory effects of four main components of rhubarb on CYPs were studied by using this automatic system. The results showed that rhubarb phenols had a strong inhibitory effect on 2E1, Rhein on 2C19O2E1, emodin on 2C8C19 and aloe emodin on 2B6O2C19. In this study, the IC50 values of three major CYPs subtypes 3A4 / 5D6D6D2C9 were determined. The inhibitory IC50 value of emodin on 3A4/5 was 15.82 mol/L,12.68 mol/L;. The IC50 value of emodin on 3A4/5 was 18.40 mol/L;. The IC50 value of Rhein to 2C9 is 24.17 mol/L,. The IC50 value of other groups is more than 25.00 mol/L.. In the further development of the medicinal value of rhubarb, the possible drug interaction or the risk of food and drug interaction caused by the compatibility of traditional Chinese medicine were provided.
【學位授予單位】：華南理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q559.9;R96

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本文編號：2422028